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Die Phenoloxydasen des Ascomyceten Podospora anserina

The phenoloxidases of the ascomycete Podospora anserina

V. Eigenschaften der laccase I nach weiterer reinigung

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Summary

0616 04

  1. 1.

    By using an improved method for purification of the laccase I of the wild type of Podospora anserina, yield and specific activity of this enzyme have been increased, whereas its stability decreased.

  2. 2.

    Freshly prepared laccase I seems to be homogeneous, according to its behavior in hydroxylapatite-chromatography, in sedimentation-analysis and in disc-electrophoresis.

  3. 3.

    The catalytic, electrophoretic, spectral and molecular properties and the carbohydrate-composition of laccase I have been investigated. Laccase I exhibits a double-pH-optimum for its reaction with dopa (at pH 5.5 and 7.5), the isoelectric point being at pH 4.9. The enzyme is reversibly inhibited by sodium azide (K i =1.9×10-6 M) and has absorption-maxima at 280 and 610 nm. The content of nitrogen, copper and carbohydrate is 13.6%, 0.3% and 23% of the dry weight, respectively. Hexosamine, mannose, glucose and galactose have been found in the carbohydrate moiety of the enzyme. The following molecular data were determined: sedimentation coefficient s 020, ω =14.47×10-13 sec, diffusion coefficient D 020, ω =3.06×10-7 cm2/sec, partial specific volume=0.701 ml/g, ratio of the frictional coefficient f/f 0=1.46. The molecular weight M s ,D (sedimentation and diffusion) is 390,000. This has been substantiated by finding a molecular weight M ω of 383,000 using equilibrium sedimentation. One molecule of laccase I contains therefore about 18 atoms of copper.

  4. 4.

    The laccase spectrum of a certain mutant strain is phenocopied if the wild type mycelium is grown in a medium of pH 5 or below.

  5. 5.

    The laccase occurs at different degrees of polymerisation. The respective sedimentation coefficients indicate that, depending on experimental conditions, aggregation to a dimer or dissociation into 4, perhaps 5 subunits, can occur. These subunits can be further split into halves.

  6. 6.

    The relation of the multiple forms of laccase I of the wild type to the laccases of some mutants of this fungus is discussed.

Zusammenfassung

  1. 1.

    Die Laccase I des Wildstammes von Podospora anserina wurde nach einer verbesserten Methode gereinigt. Dadurch konnten Ausbeute und spezifische Aktivität des Enzyms gesteigert werden. Die Stabilität nahm dagegen ab.

  2. 2.

    Das Verhalten der frisch gereinigten Laccase I bei der Chromatographie an Hydroxylapatit, in der Ultrazentrifuge und in der Disc-Elektrophorese spricht für deren molekulare Einheitlichkeit.

  3. 3.

    Die katalytischen, elektrophoretischen, spektralen und molekularen Eigenschaften sowie die Zusammensetzung der Laccase I wurden untersucht. Sie besitzt ein doppeltes pH-Optimum (pH 5,5 und 7,5), der isoelektrische Punkt liegt bei pH 4,9; sie wird durch Natriumazid reversibel gehemmt (K i =1.9·10-6 M), die Absorptionsmaxima liegen bei 280 und 610 nm. Der Stickstoffgehalt beträgt 13,6%, der Kupfergehalt 0,3%, der Kohlenhydratgehalt 23% der Trockensubstanz. Im Kohlenhydratanteil wurden Hexosamin, Mannose, Glucose und Galactose nachgewiesen. Folgende molekulare Daten wurden ermittelt: Sedimentationskonstante s 020, ω =14,47·10-13 sec, Diffusionskonstante D 020, ω =3,06·10-7 cm2/sec, partielles spezifisches Volumen=0,701 ml/g, Verhältnis der Reibungskoeffizienten f/f 0=1,46. Das Molekulargewicht liegt bei 390.000 (Sedimentation, Diffusion); dies Ergebnis wird bestätigt durch ein mit Gleichgewichtsedimentation zu 383.000 ermitteltes Molekulargewicht. Ein Laccase-I-Molekül enthält somit etwa 18 Kupferatome.

  4. 4.

    Durch veränderte Anzuchtbedingungen des Wildstamm-Mycels (pH der Nährlösung unter 5) kann das Laccasespektrum einer bestimmten Mutante phänokopiert werden.

  5. 5.

    Die Laccase kommt in verschiedenen Polymerisationsstufen vor. Aus den gewonnenen Sedimentationskonstanten läßt sich je nach Versuchsbedingungen sowohl Aggregation zu einem Dimer folgern als auch Dissoziation in 4, möglicherweise 5 aktive Untereinheiten, die nochmals in Hälften zerfallen können.

  6. 6.

    Die Beziehungen der Laccase I des Wildtyps und ihrer verschiedenen Polymerisationsstufen zu den Mutanten-Laccasen werden diskutiert.

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Authors and Affiliations

  1. Institut für Allgemeine Botanik der Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Deutschland

    H. Peter Molitoris & Karl Esser

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  1. H. Peter Molitoris
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  2. Karl Esser
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Molitoris, H.P., Esser, K. Die Phenoloxydasen des Ascomyceten Podospora anserina . Archiv. Mikrobiol. 72, 267–296 (1970). https://doi.org/10.1007/BF00412178

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