Les nitrate-réductases bactériennes

Summary

In addition to nitrate chlorate is utilized as a substrate. The enzymes of A. aerogenes and M. denitrificans probably catalyze also the reduction of bromate but not that of iodate. Nitrate reductase A has a slightly greater affinity for NO ^-₃ than for ClO ^-₃ ; but under saturating conditions chlorate is reduced at a sliggtly more rapid rate than nitrate: the ratio of chlorate- and nitrate reductase activities approaches the value of 1.5.

Nitrate reductase A present in crude extracts appears to be in particulate form.

It has been shown that enzyme A from either A. aerogenes or M. denitrificans is not inactivated when incubated in absence of its substrates in a medium made reducing by addition of reduced benzyl viologen. This property distinguishes it from the nitrate reductase of yeast Hansenula anomala.

Enzyme A is very sensitive to cyanide and azide, but versene is without effect. In the case of cyanide the inhibition is not completely reversible and the kinetics observed are not characteristic for a competitive type of action. On the other hand, inhibition by azide is completely reversible and competitive. The K _i for N ^-₃ is very low approaching 0.001 mM. This indicates that the affinity for N ^-₃ is much higher than for NO ^-₃ or ClO ^-₃ : the Michaelis constants for these two substrates are in fact of order of 1 mM. These results suggest that nitrate reductase A contains a heavy metal, the identity of which is at present unknown. The competitive character of inhibition by azide indicates that this metal may be situated close to the active center and that it could have a role in association of enzyme with the substrate.

The nitrate reductases A present in crude extracts of A. aerogenes and M. denitrificans are relatively resistant to thermal inactivation. In addition, the ratio of chlorate- and nitrate reductase activities remains constant irrespectively of temperature and duration of heating. This observation suggests that the two activities are associated with the same protein.

Résumé

Le chlorate est utilisé comme substrat. II semble que les enzymes d'A. aerogenes et M. denitrificans catalysent aussi la réduction du bromate, mais point celle de l'iodate. La nitrate-réductase A présente légèrement plus d'affinité pour NO ^-₃ que pour ClO ^-₃ ; mais, dans les conditions de saturation, le second de ces deux substrats est réduit un peu plus vite que le premier: le rapport des activités chlorate- et nitrate-réductases a une valeur proche de 1,5.

La nitrate-réductase A contenue dans les extraits bruts se présente sous la forme particulaire.

II a été vérifié que l'enzyme A d'A. aerogenes et M. denitrificans ne s'inactive pas lorsqu'on le place, en l'absence de ses substrats, dans un milieu rendu réducteur par le benzyl-viologène réduit. Cette propriété le distingue de la nitrate-réductase de la levure Hansenula anomala.

L'enzyme A est très sensible au cyanure et à l'azoture. Par contre, le versène est sans effet. Dans le cas du cyanure, l'inhibition n'est pas entièrement réversible et la cinétique observée n'est pas celle qui caractérise une action de type compétitif. En revanche, en ce qui concerne l'azoture, l'inhibition est entièrement réversible et compétitive; la constante K _i a une valeur extrêmement faible, proche de 10^-6M. Ceci indique que l'affinité présentée à l'égard de N ^-₃ est beaucoup plus élevée que celle manifestée envers NO ^-₃ ou ClO ^-₃ : pour ces deux substrats les constantes de Michaelis sont en effet de l'ordre de 1 mM. Les résultats précédents suggèrent que la nitrate-réductase A contient un métal lourd dont l'identité, à l'heure actuelle, n'est pas connue. D'autre part, le caractère compétitif de l'inhibition provoquée par l'azoture indique que ce métal pourrait être situé au niveau du site actif et jouer un rôle dans l'association de l'enzyme avec son substrat.

Les nitrate-réductases A contenues dans les extraits bruts d'A. aerogenes et M. denitrificans sont relativement résistantes à l'inactivation thermique. D'autre part, le rapport des activités chlorate- et nitrate-réductases reste constant quelles que soient la température et la durée du chauffage: cette observation appuie l'opinion selon laquelle les deux activités seraient liées à la même protéine.