Der Pathologe

, Volume 31, Supplement 2, pp 134–137 | Cite as

Multilayer-Analyse der Signaltransduktion und Zellzykluskontrolle in GIST

Identifizierung neuer Interaktionspartner mit differenzieller Regulation
  • F. Haller
  • D.J. Zhang
  • C. Löbke
  • A. von Heydebreck
  • U. Korf
  • L. Füzesi
  • Ö. Sahin
Referate Preisträger
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Zusammenfassung

Um neue Interaktionspartner und diagnostisch, prognostisch und therapeutisch relevante Unterschiede in der Regulation der Genexpression bei gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zu identifizieren, wurden in identischen Patientenproben parallel die Methylierung, die mRNA-Expression, die microRNA-Expression, die Proteinexpression und die Proteinphosphorylierung analysiert. Die Daten wurden in einer Multilayer-Analyse zusammengeführt und sowohl untereinander als auch mit klinisch-pathologischen Parametern korreliert. Differenziell regulierte Gene wurden mit bereits bekannten Signalwegen bei GIST verglichen und in einer funktionell orientierten Übersicht zusammengeführt, was neue Erkenntnisse über die Genregulation bei GIST im Zusammenhang ermöglichte.

Schlüsselwörter

Gastrointestinale Stromatumoren Methylierung mRNA microRNA Protein 

Multilayer analysis of signal transduction and cell cycle control in GIST

Indentifying new interaction partners with differential regulation

Abstract

To identify new interactions as well as diagnostically, prognostically and therapeutically relevant differences in the regulation of gene expression in gastrointestinal stromal tumors (GISTs), we analyzed the methylation status, mRNA expression, microRNA expression, protein expression and protein phosphorylation in parallel in identical tumor tissue samples. The data were analyzed in a multilayer approach and were correlated to each other and to clinico-pathological parameters. Differentially regulated genes were mapped to signal transduction pathways which are already known to play a major role in GISTs. A functionally orientated overview of the different data layers was constructed, which enabled new insights into gene regulation in GISTs.

Keywords

Gastrointestinal stromal tumors Methylation RNA, messenger microRNA Protein 

Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) treten im gesamten Gastrointestinaltrakt auf, wobei GIST des Magens ein generell weniger aggressives biologisches Verhalten zeigen als GIST des Dünn- und Dickdarms [1]. Histomorphologisch können bei Magen-GIST und Dünndarm-GIST verschiedene Wachstumsmuster unterschieden werden. Auf molekulargenetischer Ebene können GIST nach dem Genotyp in GIST mit einer KIT-Mutation, GIST mit einer PDGFRA-Mutation sowie in so genannte Wildtyp-GIST unterschieden werden [2]. Genexpressionsstudien auf mRNA-Ebene konnten zeigen, dass sowohl die anatomische Lokalisation als auch der Genotyp bei GIST mit einer differenziellen Genexpression assoziiert sind.

Die Regulation der Aktivität eines Genprodukts ist komplex und findet auf verschiedenen Ebenen statt (Abb. 1 a–f). Die Methylierung der Promoterregion reguliert die Expression auf mRNA-Ebene (Abb. 1 a). Amplifikationen führen zu einer gesteigerten Transkription (Abb. 1 b). Je mehr mRNA transkribiert wird (Abb. 1 c), desto mehr Protein wird erzeugt (Abb. 1 e). MicroRNAs sind an dieser Stelle eingreifende, zwischengeschaltete Feinregulatoren, welche die mRNA wieder abbauen können, bevor das Protein gebildet werden kann (Abb. 1 d). Die Aktivität vieler Proteine wird häufig zusätzlich posttranslational reguliert, z. B. über Modifikationen wie Phosphorylierungen (Abb. 1 f).

Abb. 1

Verschiedene Regulationsebenen der Genexpression und -aktivität. a Methylierung der Promoterregion der DNA, b Amplifikationen des kodierenden DNA-Abschnitts, c mRNA-Expression, d microRNA-Expression, e Proteinexpression, f posttranslationale Proteinaktivierung, z. B. durch Phosphorylierung

Ziel dieser Studie war es, Daten auf verschiedenen Ebenen der Genregulation bei GIST zu erheben und unter Berücksichtigung der bei GIST bekannten Signalwege zusammenzuführen, um neue und funktionell relevante Geninteraktionen identifizieren zu können.

Analyse der Promotermethylierung

Die Methylierung der Promoterregionen von 807 krebsrelevanten Genen (insgesamt 1505 CpG-Loci) wurde in 61 primären GIST mittels der „Illumina Golden Gate Plattform“ („Illumina Golden Gate Cancer Methylation Panel“) analysiert [3]. Die Methylierung der einzelnen CpG-Loci wurde mit den klinisch-pathologischen Parametern und dem Follow-up korreliert. Bei GIST mit einer KIT-Mutation waren im Vergleich zwischen Magen-GIST und Dünndarm-GIST 115 CpG-Loci differenziell methyliert. Im Gegensatz dazu konnten im Vergleich von GIST des Magens mit einer KIT- bzw. PDGFRA-Mutation 102 differenziell methylierte CpG-Loci identifiziert werden, die signifikant mit dem Genotyp assoziiert waren. 235 CpG-Loci waren im Vergleich von GIST mit <5 vs. >5 Mitosen pro 50 hochauflösende Gesichtsfelder (HPFs) unterschiedlich methyliert.

Analyse der mRNA-Expression

Die mRNA-Expression wurde zunächst mittels „Whole-Genome Oligonucleotid Arrays“ („Illumina Golden Gate“) in 24 GIST untersucht [3]. In der Analyse waren 144 Gene im Vergleich von Magen-GIST mit KIT- bzw. PDGFRA-Mutation differenziell exprimiert, während die Expression von 531 Genen mit der anatomischen Lokalisation bzw. von 392 Genen mit der Mitosenanzahl assoziiert war. Die differenzielle Expression wurde exemplarisch für 10 Gene mittels quantitativer „Real-time-RT-Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)“ in 61 GIST bestätigt [3, 4].

Analyse der microRNA-Expression

Die microRNA-Expression wurde zunächst in 12 GIST mittels eines Oligonukleotid-Arrays (miRXplore Microarray, Miltenyi Biotec GmbH) analysiert, wobei der Array 734 humane microRNAs abdeckte [5]. Die Expression von 16 microRNAs war mit der anatomischen Lokalisation assoziiert, während 21 microRNAs eine differenzielle Expression in Zusammenhang mit dem Genotyp aufwiesen. Die differenzielle Expression von 4 microRNAs wurde mittels quantitativer Real-time-RT-PCR in 61 GIST bestätigt.

Analyse der Proteinexpression

Die Proteinexpression wurde auf 2 unterschiedliche Arten untersucht: Von 61 GIST wurde Zellextrakt isoliert und auf Objektträger gespottet, und die Proteinmenge von 50 verschiedenen Proteinen bzw. Phosphoproteinen wurde quantitativ mittels so genannter „Reverse-Phase-Protein-Arrays“ bestimmt [6, 7]. Parallel wurden von 198 GIST aus paraffineingebettetem Tumorgewebe „Tissue-Microarrays“ hergestellt und ebenfalls 50 Proteine mittels Immunhistochemie untersucht [8, 9]. Um eine exakte Analyse der immunhistochemischen Färbungen zu ermöglichen, wurden von jedem Tumor 6 Stanzen gefärbt, digital fotografiert und mittels einer selbstentwickelten Software quantitativ ausgewertet [10].

Multilayer-Analyse

Die bei GIST bereits nachgewiesenen aktivierten Signalwege wurden aus Publikationen herausgesucht. Die verschiedenen eigenen Datensätze wurden zusammengeführt und auf potenzielle Geninteraktionen auf den verschiedenen Regulationsebenen untersucht. Informationen über bereits bekannte Interaktionen wurden aus verschiedenen Datenbanken (KEGG, miRBase, TargetScan) extrahiert und in die Analyse aufgenommen. Es zeigte sich eine teilweise hochsignifikante differenzielle Expression bzw. Aktivierung zentraler Signalwege in Assoziation mit klinisch-pathologischen Parametern wie der anatomischen Lokalisation, dem Genotyp oder der Mitosenanzahl (Abb. 2). Insgesamt konnten sowohl die Bedeutung bereits bekannter Signalwege bei GIST bestätigt werden als auch neue, potenziell diagnostisch, prognostisch oder therapeutisch relevante Interaktionen auf verschiedenen Ebenen identifiziert werden.

Abb. 2

Übersicht über differenzielle Regulation von bekannten Signalwegen bei GIST. Proteine sind als Kreise dargestellt, microRNAs als Rauten. Unterstrichene Proteine zeigten eine gute Korrelation zwischen mRNA- und Proteinexpression sowie eine differenzielle Expression in Assoziation mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern. P zeigt Phosphorylierungsstellen an. Das blaue Dreieck zeigt Gene an, deren mRNA-Expression stark mit der Promotermethylierung korrelierte

Fazit für die Praxis

Bei GIST ist die Aktivierung zentraler Signalwege teilweise mit der anatomischen Lokalisation, dem Genotyp und der Mitosenanzahl korreliert, wobei auf verschiedenen Ebenen der Genregulation Unterschiede bestehen. Eine umfassende Analyse der Genexpression bzw. Proteinaktivität auf verschiedenen Ebenen an den gleichen Patientenproben hat den Vorteil, ein umfassenderes, funktionell relevantes Bild der Regulation zu liefern, und kann neue Interaktionen aufdecken. Diese Multilayer-Methode wird helfen, in der Zukunft weitere diagnostische, prognostische und therapeutisch relevante Faktoren bei GIST zu identifizieren.

Notes

Interessenkonflikt

Der korrespondierende Autor weist auf folgende Beziehungen hin: Reisekostenübernahme und Referententätigkeit für Novartis Oncology mit Honorar; Forschungsdrittmittel von Novartis Oncology.

Literatur

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Copyright information

© Springer-Verlag 2010

Authors and Affiliations

  • F. Haller
    • 1
    • 4
  • D.J. Zhang
    • 2
  • C. Löbke
    • 2
  • A. von Heydebreck
    • 3
  • U. Korf
    • 2
  • L. Füzesi
    • 4
  • Ö. Sahin
    • 2
  1. 1.Institut für allgemeine Pathologie und pathologische AnatomieUniversitätsklinikum FreiburgFreiburgDeutschland
  2. 2.Deutsches Krebsforschungszentrum, HeidelbergHeidelbergDeutschland
  3. 3.Merck KGaA, DarmstadtDarmstadtDeutschland
  4. 4.Institut für PathologieUniversitätsmedizin GöttingenGöttingenDeutschland

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