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Bioassay Guided Analysis of Migrants from Can Coatings

  • N. Mittag
  • S. Förster
  • S. Hoppe
  • T. J. Simat
  • A. Sehr
  • S. Renz
  • M. Vobach
  • U. Kammann
Original Paper

Abstract.

Migrants from can coatings consist of a complex mixture of a variety of substances that mostly are not toxicologically evaluated. 95% ethanolic migrates from a polyester and an epoxy coating were screened in different bioassays on mutagenicity (Ames II-Test), on aquatic toxicity (Fish Embryo Assay) and on cytotoxicity (BrdU-ELISA, WST-1-Assay, Neutral Red Assay (NRA), RNA-Synthesis-Inhibition). No mutagenic effect was detected in the Ames II-Test and no lethal effects were induced in the fish embryo test up to a concentration of 60 dm2/l. Strongly varying cytotoxicity effects have been determined depending on the type of the assay, the cell line in use (Hela-S3, Caco-2, HT-29, Hep-G2) as well as the incubation conditions.

The NRA was validated for the investigation of the coating migrates. Legally regulated substances known to migrate from epoxy coatings, BPA, BADGE, BADGE*2H2O, BADGE*HCl*H2O and BADGE*2HCl were investigated in the NRA with two different cell lines, a human colon adenocarcinoma cell line (HT-29) and a human hepatocellar carcinoma cell line (Hep-G2). The IC50, Hep-G2-values of the regulated epoxy based substances ranged from 7 mg/l for BADGE to 83 mg/l for BADGE*2H2O. The 95% ethanolic migrate of the epoxy coating revealed a significant effect in the NRA (IC50, Hep-G2 =  6.6 ±  0.8 dm2/l) while the polyester coating induced no effect (IC50, Hep-G2  >  30 dm2/l). The amount of the legally regulated substances (BPA, BADGE, BADGE*2H2O) in the migrate of the epoxy coating was analysed and their part on the cytotoxic effect of the migrate was estimated. Only about 0.5% of the effect of the migrate in the NRA could be traced back to these substances.

Keywords.

Bioassay can coatings Ames II-Test Fish Embryo Test BrdU-ELISA WST-1-Assay Neutral Red Assay RNA-Synthesis-Inhibition migration consumer safety 

Abbreviations

2-NF

2-nitrofluorene

4-NQO

4-nitroquinoline N-Oxide

ABTS

2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)

BADGE

bisphenol A diglycidyl ether

BPA

bisphenol A

BrdU

5-bromo-2’-deoxyuridine

Caco-2

human colon adenocarcinoma cell line

DMF

N,N-dimethylformamide

DMSO

dimethyl sulfoxide

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELSD

evaporative light scattering detector

EtOH

ethanol

FBS

foetal bovine serum

FL

fluorescence

Hela-S3

human cervix carcinoma cell line

Hep-G2

human hepatocellular carcinoma cell line

HPLC

high performance liquid chromatography

HT-29

human colon adenocarcinoma cell line

IC

inhibition concentration

IZW

Informationszentrum Weißblech

LC

liquid chromatography

MS

mass spectroscopy

MV

mean value

NRA

Neutral Red Assay

OD600

optical density at 600 nm

OECD

Organisation for Economic Cooperation and Development

POD

peroxidase

RNA

ribonucleic acid

SD

standard deviation

SDS

sodiumdodecylsulfate

SML

specific migration limit

TA 98

Salmonella typhimurium strain 98

TA 100

Salmonella typhimurium strain 100

TMA

trimellitic acid

UV

ultra violet

WST

tetrazolium salt: 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H- 5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate

Zusammenfassung.

Migrate aus Innenbeschichtungen von Konservendosen bestehen aus einer Vielzahl von Substanzen, welche größtenteils nicht toxikologisch bewertet sind. 95% ethanolische Migrate eines Polyestercoatings und Epoxidcoatings wurden in verschiedenen Biotests auf Mutagenität (Ames II-Test), auf aquatische Toxozität (Fischembryo-Test) und auf Zytotoxizität (BrdU-ELISA, WST-1-Assay, Neutralrot-Test, RNA-Synthese-Inhibition) untersucht. Bis zu einer Konzentration von 60 dm2/l konnten sowohl im Ames II-Test keine mutagenen Effekte als auch im Fischembryo-Test keine letalen Effekte bestimmt werden. Die erhaltenen Ergebnisse aus den Bestimmungen zur Zytotoxizität variieren stark; dies liegt begründet in der Art des Testsystems, der eingesetzten Zelllinie (Hela-S3, Caco-2, HT-29, Hep-G2) und den gewählten Inkubationsbedingungen.

Der Neutralrot-Test wurde für die Untersuchungen an Migraten aus Innenbeschichtungen von Konservendosen validiert. Bekannte gesetzlich geregelte Substanzen in Migraten aus epoxidhaltigen Coatings, BPA, BADGE, BADGE*2H2O, BADGE*HCl*H2O und BADGE*2HCl wurden im Neutralrot-Test an 2 unterschiedlichen Zelllinien, einer humanen Kolonkarzinomzelllinie (HT-29) und einer humanen Hepatoblastomzelllinie (Hep G2) untersucht. Die IC50, Hep-G2-Werte der gesetzlich regulierten epoxidhaltigen Substanzen liegen zwischen 7 mg/l für BADGE und 83 mg/l für BADGE*2H2O. Während das 95% ethanolische Migrat des Epoxidcoatings einen signifikanten Effekt im Neutralrot-Test (IC50, Hep-G2 =  6.6 ±  0.8 dm2/l) induziert, wird durch das Migrat des Polyestercoatings kein Effekt hervorgerufen (IC50, Hep-G2  >  30 dm2/l). Die Gehalte der gesetzlich geregelten Substanzen (BPA, BADGE, BADGE*2H2O) im Migrat des Epoxidcoatings wurden bestimmt und deren Anteil am zytotoxischen Effekt des Migrates abgeschätzt. Nur ca. 0,5% des zytotoxischen Effektes des Migrates im Neutralrot-Test kann auf diese Substanzen zurückgeführt werden.

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Copyright information

© Birkhäuser Verlag, Basel 2006

Authors and Affiliations

  • N. Mittag
    • 1
  • S. Förster
    • 1
  • S. Hoppe
    • 1
  • T. J. Simat
    • 1
  • A. Sehr
    • 2
  • S. Renz
    • 2
  • M. Vobach
    • 3
  • U. Kammann
    • 3
  1. 1.Faculty of Science, Department of Chemistry and Food Chemistry, Institute of Food ChemistryTechnical University of DresdenDresdenGermany
  2. 2.Federal Environmental Agency of Bad ElsterBad ElsterGermany
  3. 3.Federal Research Center for FisheriesInstitute for Fishery EcologyHamburgGermany

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