Über den Nachweis von Insulin mit den metachromatisch reagierenden Pseudoisocyaninen

  • T. H. Schiebler
  • S. Schiessler
Article
Received:

Zusammenfassung

1. Im Cytoplasma der insulinbildenden B-Zellen menschlicher und tierischer Pankreasinseln sowie in dem der sog. dunklen Zellen der Brockmannschen Körperchen der Schleie finden wir Granula, die mit Pseudoisocyaninfarbstoffen nach Oxydation metachromatisch reagieren.

2. Reininsulin sowie alle bei der technischen Insulingewinnung aus Bauchspeicheldrüsen entstehenden insulinhaltigen Fraktionen reagieren mit Pseudoisocyaninen nach Oxydation ebenfalls metachromatisch.

3. Die metachromatische Reaktion des oxydierten Insulins bzw. der B-Zellstrukturen ist auf die Bildung von SO 3 − -Gruppen zurückzuführen. Diese entstehen bei der Perameisensäure- bzw. Kaliumpermanganatbehandlung durch oxydative Aufspaltung der Disulfidbrücken.

4. Mit der Pseudoisocyaninreaktion, deren Durchführung genau beschrieben wird, wird das in den B-Zellen der Langerhansschen Inseln vorkommendeInsulin selbst nachgewiesen.

5. Von den verschiedenen zur metachromatischen Darstellung der B-Zellen geeigneten Pseudoisocyaninen ist das N,N′-Diäthyl-6,6′-dichlorpseudoisocyaninchlorid besonders zu empfehlen, da die mit diesem Farbstoff gefärbten Präparate mit Chloroform entwässert und in Caedax eingedeckt werden können. Auf diese Weise ist die Herstellung von Dauerpräparaten möglich. Das leichter erhältliche N,N′-Diäthylpseudoisocyaninchlorid oder -bromid (Firma AGFA, Leverkusen) kann jedoch genauso verwendet werden, wenn die Präparate nach der Färbung und kurzem Wässern in wasserlösliche Eindeckmittel eingeschlossen werden.

6. Die Pseudoisocyaninreaktion besitzt für den Insulinnach weis einehohe Spezifität. Nur Proteine, bei deren oxydativer Behandlung wenigstens zwei unmittelbar benachbarte SO 3 − -Gruppen (Abstand 4–5 Å) gebildet werden, reagieren metachromatisch. Eine derartige Gruppierung liegt bei der durch die Perameisensäure-Oxydation von Insulin entstehenden Polypeptidfraktion A vor. Fraktion B, bei der die SO 3 − -Gruppen räumlich weit entfernt sind, reagiert negativ. Ebenso ist mit unoxydiertem und oxydiertem Oxytocin, Glutathion und Eieralbumin sowie Aminosäuren, unter ihnen Cystin, Cystein und Cysteinsäure, ihr Oxydationsprodukt, keine metachromatische Reaktion zu erzielen.

7. In den B-Zellen von oxydierten Schnitten durch Pankreasinseln fehlt bei der Färbung mit anderen als metachromatisch bekannten Farbstoffen (Toluidinblau, Methylenblau, Acridinorange) eine metachromatische Reaktion. Dies wird darauf zurückgeführt, daß mit Pseudoisocyanin im Gegensatz zu den anderen metachromatisch wirkenden Farbstoffen bereits beim Vorliegen von Substanzen mit nur zwei oder wenigen negativen Gruppen Metachromasie zu erzielen ist.

8. Die Darstellung von Insulin im oxydierten histologischen Präparat mit Hilfe der Pseudoisocyaninreaktion gelingt nur nach Fixierung mit formalinhaltigen Gemischen, jedoch nicht nach Alkohol- oder Acetonfixierung. Möglicherweise wird Insulin aus alkohol- oder acetonfixiertem Gewebe durch die sauren Oxydationsmittel herausgelöst, da diese Fixierungsmittel lediglich eine Eiweißfällung bewirken. Bei Verwendung von formolhaltigen Gemischen kann dagegen durch Vernetzung von Insulin mit anderen Proteinen ein säureunlösliches Kondensationsprodukt entstehen.

Summary

1. The cytoplasm of the insulin-producing B-cells of the islets of Langerhans contains granula which show a metachromatic reaction after oxidation and colouring with pseudoisocyanins. Such granula can be found in human and mammalian islets, as well as in the insulin-producing tissue of a fish, Tinca vulgaris.

2. Pure insulin as well as all insulin containing fractions obtained during the process of technical isolation of insulin react metachromatically with pseudoisocyanines when oxidized prior to the colouring.

3. The metachromatic reaction of oxidized insulin and of some cytoplasmic structures of B-cells is due to the presence of SO 3 − -groups. They are formed by the splitting of disulphide bonds on treatment with performic acid or potassium permanganate.

4. The metachromatic reaction with pseudoisocyanins, which is described in detail, can be used for thedetection of insulin in the islets of Langerhans.

5. Several pseudoisocyanins can be employed for the histochemical colouring of B-cells. NN′-Diäthyl-6,6′-dichlorpseudoisocyaninchlorid, however, is the most suitable compound since it allows the dehydration of the slides with chloroform after staining. Coverslips can than be mounted with Caedax and the preparates can be made permanent. NN′-Diäthylpseudoisocyaninchlorid, which can be obtained more easily since it is produced commercially by AGFA-Leverkusen, can also be used, but after staining and rinsing in water the slides must be mounted with a water soluble medium.

6. The reaction with pseudoisocyanins ishighly specific for the detection of insulin. Only proteins, which are characterised by at least two closely neighbouring SO 3 − -groups (distance about 4–5 Å) react metachromatically. Such a configuration of SO 3 − -groups occurs in the polypeptide fraction A, which is formed by oxydation of insulin with performic acid. Fraction B does not react metachromatically since its SO 3 − -groups are not located closely enough to each other. No metachromatic reaction is seen after staining of either unoxydized or oxydized oxytocine, glutathione, eggalbumen and amino acids such as cystine, cysteine or its oxydized form, cysteinic acid.

7. B-cells of oxydized slices of pancreatic islets show no metachromasia with other dye stuffs such as toluidine blue, methylen blue and acridine orange, which are commonly known for their metachromatic effects. It is believed that pseudoisocyanine reacts metachromatically already with two negative groups, whereas the other dyes require a greater number of negative groups.

8. Insulin can be characterized in oxydized histological slides only after fixation with formaline-containing solutions, but not after fixation with alcohol or acetone. Since alcohol and aceton merely precipitate the proteins, it can be assumed, that the insulin is eluted by the acidic oxidants when alcohol and acetone have been used for fixation. Formalin on the other hand can react with insulin and other proteins and build up an acid-insoluble condensation product.

This is a preview of subscription content, log in to check access.

Preview

Unable to display preview. Download preview PDF.

Unable to display preview. Download preview PDF.

Literatur

  1. Adams, C. W. M., andJ. C. Sloper: The hypothalamic elaboration pituitary principles in man, the rat and dog. Histochemical evidence dirived from a performic acid-Alcianblue reaction for cystine. J. Endocr.13, 221–228 (1956).Google Scholar
  2. Appel, W., u.G. Scheibe: Über die Bildung reversibler Polymerisate des Pseudoisocyanins durch polare kettenförmige Hochpolymere (Heparin). Z. Naturforsch.13, 359–364 (1958).Google Scholar
  3. Bargmann, W.: Die Langerhansschen Inseln des Pankreas. In Handbuch der mikroskopischen Anatomie des Menschen, Bd. VI/2. Berlin: Springer 1939.Google Scholar
  4. Barrnett, R. J., R. B. Marshall andA. M. Seligman: Histochemical demonstration of insulin in the islet of Langerhans. Endocrinology57, 419 bis 438 (1955).Google Scholar
  5. Booij, H. L.: Colloid chemical aspects of metachromasia. Acta histochem. (Jena) Suppl.1, 37–54 (1958).Google Scholar
  6. Burstone, M. S.: Histochemical methods for protein detection. In Handbuch der Histochemie, Bd. III/2. Stuttgart: Georg Fischer 1959.Google Scholar
  7. Caesar, R.: Zur Cytologie der Inselorgane von Teleostiern mit besonderer Berücksichtigung des Kolloidvorkommens. Z. Zellforsch.40, 571–584 (1954).Google Scholar
  8. Ferner, H.: Das Inselsystem des Pankreas. Stuttgart: Georg Thieme 1952.Google Scholar
  9. Fischer, O., u.G. Scheibe: Beitrag zur Kenntnis der Chinocyanine. J. prakt. Chem.100, 86 (1920).Google Scholar
  10. Fisher, E. R., andR. D. Lillie: The effect of methylation on basophilia. J. Histochem. Cytochem2, 81–87 (1954).Google Scholar
  11. Graumann, W., u.H. Musso: Histologische Prüfung der metachromogenen Wirksamkeit verschiedener Toluidinblau- und Azur A-Präparate. Histochemie1, 196–205 (1959).Google Scholar
  12. Kelly, J. W.: The metachromatic reaction. Protoplasmatologia, Bd. II/D 2. Wien: Springer 1956.Google Scholar
  13. Konečný, M., u.Z. Pličzka: Über die Möglichkeiten der Anwendung des Aldehyd-Fuchsins (Gomori) in der Histochemie. Acta histochem. (Jena)5, 247–260 (1958).Google Scholar
  14. Kracht, J.: Experimentelle Morphologie des Inselorgans unter BZ 55, D 860 und IPTD. Medizinische12, 525–528 (1959).Google Scholar
  15. Lacy, P. E., andJ. Davies: Preliminary studies on the demonstration of insulin in the fluorescent antibody technic. Diabetes6, 354–357 (1957).Google Scholar
  16. Demonstration of insulin in mammalian pancreas by the fluorescent antibody method. Stain Technol.34, 85–89 (1959).Google Scholar
  17. Leuthardt, F.: Lehrbuch der physiologischen Chemie, 13. Aufl. Berlin: W. de Gruyter & Co. 1957.Google Scholar
  18. Lison, L.: Histochemie et cytochimie animales. Paris 1953.Google Scholar
  19. Michaelis, L.: Theory of metachromatic staining. Biol. Bull.87, 155–156 (1944).Google Scholar
  20. Müller, W.: Astrablau zur Darstellung des sog. Neurosekretes. Lab.-Bl. (Marburg)7, 39–44 (1957).Google Scholar
  21. Rodeck, H.: Zur färberischen Darstellung des Insulins. Ärztl. Wschr.13, 871 (1958).Google Scholar
  22. Sandritter, W., U. Becker, D. Müller u.E. F. Pfeiffer: Histochemische Untersuchungen zur Frage der Funktion der B-Zellen der Langerhansschen Inseln nach Stimulierung mit D 860. Endokrinologie37, 193–217 (1959).Google Scholar
  23. Sanger, F.: Oxidation of insulin by performic acid. Nature (Lond.)160, 295 (1947).Google Scholar
  24. Fractionation of oxidized insulin. Biochem. J.44, 126–128 (1949).Google Scholar
  25. Schätzle, W.: Histochemie des Inselapparates. Acta histochem. (Jena)6, 93–132 (1958).Google Scholar
  26. Schauer, A., u.G. Scheibe: Mündliche Mitteilung durch VZanker auf dem V. Symposion für Histochemie, Kiel 1957 [vgl. Acta histochem. (Jena), Suppl.1, 31].Google Scholar
  27. Über die Verwendung der reversibel polymeren Metachromasie von Pseudoisocyanin zur Gewebsfärbung. Histochemie1, 190–195 (1959).Google Scholar
  28. Scheibe, G.: Zur Kenntnis der Cyanine. Diss. Erlangen 1918.Google Scholar
  29. Die Synthese des Pseudoisocyanins und des Chiolinrots. Ber. chem. Ges.54, 786 (1921).Google Scholar
  30. Über die Veränderlichkeit der Absorptionsspektren in Lösungen und die Nebenvalenzen als ihre Ursache. Z. angew. Chem.50, 218 (1937).Google Scholar
  31. Reversible Polymerisation als Ursache neuartiger Absorptionsbanden von Farbstoffen. Kolloid-Z.82, 1–14 (1938).Google Scholar
  32. Die Stereoisomerie organischer Farbstoffe und ihr Zusammenhang mit Konstitution und Eigenschaften reversibler polymerer Farbstoffe. Z. angew. Chem.52, 631–637 (1939).Google Scholar
  33. Wechselseitige Bindung und Energieübertragung in Molekeln in flüssiger Phase. Z. Elektrochem.52, 283–292 (1948).Google Scholar
  34. Scheibe, G., L. Kandler u.H. Ecker: Polymerisation und polymere Adsorption als Ursache neuartiger Absorptionsbanden von organischen Farbstoffen. Naturwiss.25, 75 (1937).Google Scholar
  35. Scheibe, G., A. Mareis u.H. Ecker: Über reversible Polymerisation als Ursache neuartiger Absorptionsbanden. Naturwiss.25, 474–475 (1937).Google Scholar
  36. Scheibe, G., R. Müller u.R. Schiffmann: Beziehungen der Lichtabsorption zur räumlichen Anordnung von Molekülaggregaten. Z. phys. Chem., Abt. B49, 324 (1941).Google Scholar
  37. Scheibe, G., u.A. Schauer: Über den metachromatischen Effekt des Pseudoisocyanins an histologischen Geweben. S.-B. bayer. Akad. Wiss.1958, 14.Google Scholar
  38. Scheibe, G., u.S. Schiessler: Über die metachromatische Reaktion von oxydiertem Insulin mit Pseudoisocyaninen (in Vorbereitung).Google Scholar
  39. Scheibe, G., u.V. Zanker: Physiko-Chemische Grundlagen der Metachromasie. Acta histochem. (Jena) Suppl.1, 6–35 (1958).Google Scholar
  40. Schiebler, T. H.: Darstellung der B-Zellen in Pankreasinseln und von Neurosekret mit Pseudoisocyanin. Naturwiss.45, 214 (1958).Google Scholar
  41. Schiessler, S.: Über den Zusammenhang zwischen der reversiblen Polymerisation und der Molekülstruktur in der Klasse der Pseudoisocyanine. Inaug.-Diss. T. H. München 1958.Google Scholar
  42. Seiffert, W.: Inaug.-Diss. T. H. München (in Vorbereitung).Google Scholar
  43. Spicer, S. S., andR. D. Lillie: Saponification as a means of selectively reversing the methylation blockade of tissue basophilia. J. Histochem. Cytochem.7, 123–125 (1959).Google Scholar
  44. Sylvén, B.: Metachromatic dye-substrate interactions. Quart. J. micr. Sci.95, 327–358 (1954).Google Scholar
  45. On the interaction between metachromatic dyes and various substrates of biological interest. Acta histochem. (Jena) Suppl.1, 79–84 (1958).Google Scholar
  46. Wallraff, J.: Eine vergleichende gewebs- und methodenkritische Untersuchung der Eiweiß-, Kohlenhydrat- und Fettstoffkomponenten komplexer Organbestandteile. Histochemie1, 343–390 (1959).Google Scholar
  47. Zeiger, K.: Vorgänge bei der histologischen Fixation mit chemischen Mitteln. Acta histochem. (Jena) Suppl.1, 176–203 (1958).Google Scholar
  48. Zimmermann, H., u.G. Scheibe: Zur Konstitution und Lichtabsorption der reversibel polymeren Form des Pseudoisocyanins. Z. Elektrochem.60, 566–569 (1956).Google Scholar

Copyright information

© Springer-Verlag 1959

Authors and Affiliations

  • T. H. Schiebler
    • 1
    • 2
  • S. Schiessler
    • 1
    • 2
  1. 1.Aus dem Physikalisch-Chemischen Institut der Technischen Hochschule MünchenGermany
  2. 2.dem Anatomischen Institut der Universität KielGermany

Personalised recommendations