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Die Gefrier-Fixation lebender Zellen und ihre Anwendung in der Elektronenmikroskopie

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Zusammenfassung

Der Gefriervorgang in den Zellen hängt in erster Linie ab von der Gefriergeschwindigkeit, der Frosthärte des Objektes und von der Konzentration eines Frostschutzmittels (Glyzerin) im Zytoplasma. Für die meisten Untersuchungen wurde Preßhefe als Testobjekt verwendet. Der Einfluß der Gefriergeschwindigkeit äußert sich auf drei verschiedene Weisen; das Zellwasser kristallisiert entweder extra oder intrazellulär oder es wird amorph verfestigt (Vitrifikation). Die Bestimmung von Gefrierpunkt, Unterkühlbarkeit und Rekristallisationspunkt ermöglicht eine Erklärung dieser drei Wirkungsweisen und führt zu einem physikalischen Verständnis des Phänomens der Frosthärte. Physikalische Untersuchungen zeigen, wie das Frostschutzmittel eine Erhöhung der Frosthärte bewirkt; physiologische Experimente veranschaulichen einige Nebenwirkungen des Glyzerins.

Die Verwirklichung des Gefrierens lebender Zellen hängt in erster Linie von der Wahl geeigneter Gefriergeschwindigkeiten und Frostschutzmitteln ab. Die Endtemperatur des Gefriervorganges muß, je nach der Frosthärte des Objektes, d. h. je nach dem tiefsten in den Zellen auftretenden Rekristallisationspunkt, unter −50 bis −70° C liegen.

Das Anwendungsgebiet des Gefrierens lebender Zellen ist sowohl auf biologischem wie auch auf medizinischem Gebiete sehr groß, sei es als reine Gefrierkonservierung oder in der Gefrier-Trocknung oder -Substitution. Mit Hilfe der Gefier-Ätzung können hochauflösende, elektronenmikroskopische Bilder der gefrorenen Objekte hergestellt werden, die vollkommen artefaktfrei sind, insbesondere frei von den durch die üblichen Präparationsmethoden eingeführten Veränderungen.

Einige Beispiele illustrieren die Anwendung des Gefrierens lebender Zellen in der Elektronenmikroskopie. Die Methode der Gefrier-Ätzung ist besonders geeignet für die Darstellung der auf den Zytomembranen lokalisierten Partikel; z. B. Fibrillen synthetisierende Partikel in der Plasmamembran, Ribosomen auf einer Vakuolenmembran, Elementarpartikel auf den Cristae mitochondriales und Quantasomen auf den Granalamellen eines Chloroplasten. Die vielfältige Anwendbarkeit der Gefrier-Ätzung wird aufgezeigt an Hand von Mikroorganismen (Hefe), pflanzlichen (Wurzelspitze) und tierischen Zellen (Dünndarmepithel).

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Literatur

  1. Ashwood-Smith, M. J.: Preservation of mouse bone marrow at −79° C with dimethyl sulfoxide. Nature (Lond.) 190, 1204–1205 (1961).Google Scholar
  2. Blackmnn, M., and N. D. Linsgarten: Electron diffraction investigations into the cubic and other structural forms of ice. Advanc. Physics 7, 189–198 (1958).Google Scholar
  3. Branton, D., and H. Moor: The fine structure of freeze-etched allium cepa root tips. J. Ultrastruct. Res. (1964) (im Druck).Google Scholar
  4. Calvin, M.: The path of carbon in photosynthesis. Science 135, 879–889 (1962).Google Scholar
  5. Dowell, L. G., and A. P. Rinfret: Low temperature forms of ice studied by X-ray diffraction. Nature (Lond.) 188, 1144–1148 (1960).Google Scholar
  6. Fernandez-Morán, H.: Low-temperature preparation techniques for electron microscopy of biological specimens based on rapid freezing with liquid helium II. Ann. N. Y. Acad. Sci. 85, 689–713 (1960).Google Scholar
  7. —: The fine structure of vertebrate and invertebrate photoreceptors as revealed by low-temperature electron microscopy. In: The structure of the eye, herausgeg. von, G. K. Smelser, p. 521–556. New York: Academic Press 1961.Google Scholar
  8. —: Cell-membrane ultrastructure: Low temperature electron microscopy and X-ray diffraction studies of lipoprotein components in lamellar systems. Circulation 26, 1039–1065 (1962).Google Scholar
  9. Geneves, L.: Recherches sur les effets cytologiques du froid. Rev. Cytol. Biol. Végétales 16, 1–207 (1955).Google Scholar
  10. Hofer, A.: Intrazelluläre Legalisation der Polyphenoloxydasen in Tabakblättern. Planta (Berl.) (1964) (im Druck).Google Scholar
  11. James, W. O., and V. S. R. Das: The organisation of respiration in chlorophyllous cells. New Phytol. 56, 325–343 (1957).Google Scholar
  12. Kreutz, W.: Strukturuntersuchungen an Plastiden: IV. Über das zweidimensionale Gitter in der Proteinlamelle. Z. Naturforsch. 18b, 567–571 (1963).Google Scholar
  13. —, u. W. Menke: Strukturuntersuchungen an Plastiden: III. Röntgenographische Untersuchungen an isolierten Chloroplasten und Chloroplasten lebender Zellen. Z. Naturforsch. 17b, 675–683 (1962).Google Scholar
  14. Luyet, B. J.: The devitrification temperatures of solutions of a carbohydrate series. J. Phys. Chem. 43, 881–885 (1939).Google Scholar
  15. Mason, B.: The supercooling and nucleation of water. Advanc. Physics 7, 221–234 (1958).Google Scholar
  16. Moor, H.: Platin-Kohle-Abdruck-Technik angewandt auf den Feinbau der Milchröhren. J. Ultrastruct. Res. 2, 393–422 (1959).Google Scholar
  17. —: Reaktionsweisen der Pflanzen auf Kälteeinflüsse. Z. schweiz. Forstv. 30, Beiheft „Festschrift Prof. Frey-Wyssling“, 211–222 (1960).Google Scholar
  18. —: Gefriertrocknung. In: Moderne Methoden der Pflanzenanalyse, herausgeg. von, H. F. Linskens und M. V. Tracey, Bd. 5, S. 73–96. Berlin-Göttingen-Heidelberg: Springer 1962.Google Scholar
  19. Moor, H., and K. Muehlethaler: Fine structure in frozen-etched yeast cells. J. Cell Biol. 17, 609–628 (1963).Google Scholar
  20. — H. Waldner, and A. Frey-Wyssling: A new freezing ultramicrotome. J. biophys. bioohem. Cytol. 10, 1–13 (1961).Google Scholar
  21. - C. Ruska u. H. Ruska: Elektronenmikroskopische Darstellung tierischer Zellen mit der Gefrierätztechnik. Z. Zellforsoh. (1964) (im Druck).Google Scholar
  22. Nash, T.: Prevention of freezing damage to living cells by pyridine n-Oxide. Nature (Lond.) 192, 360–361 (1961).Google Scholar
  23. Park, R. B., and N. G. Pon: Chemical composition and substructure of lamellae isolated from Spinacea oleracea chloroplasts. J. molec. Biol. 6, 105–114 (1963).Google Scholar
  24. Sakai, A.: Survival of plant tissue at super-low temperature. II. Low Temp. Sci., Ser. B 16, 41–53 (1958).Google Scholar
  25. —: Relation of sugar content to frosthardiness in plants. Nature (Lond.) 185, 698–699 (1960).Google Scholar
  26. Smith, A. U.: The action of glycerol and related substances. In: Biological applications of freezing an drying, herausgeg. von, R. J. C. Harris, S. 31–42. New York: Academic Press 1954.Google Scholar
  27. Steere, R. L.: Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J. biophys. biochem. Cytol. 3, 45–60 (1957).Google Scholar
  28. Stoeckenius, W.: Some observations on negatively stained mitochondria. J. Cell Biol. 17, 443–454 (1963).Google Scholar
  29. Terumoto, J.: The relation between the cell sap concentration and the frosthardiness of the table beet. Low Temp. Sci., Ser. B 16, 7–21 (1958).Google Scholar
  30. Wilding, D. M., M. A. Stahmann, and D. Smith: Free amino acids in alfalfa as releated to cold hardiness. Plant Physiol. 35, 726–732 (1960).Google Scholar
  31. Zelitch, J., and G. A. Barber: Oxydative enzymes of spinach chloroplasts. Plant Physiol. 35, 626–631 (1960).Google Scholar

Copyright information

© Springer-Verlag 1964

Authors and Affiliations

  • H. Moor
    • 1
  1. 1.Laboratorium für ElektronenmikroskopieInstitut für Allgemeine Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule ZürichSwitzerland

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