Optimization of a Real-Time RT-PCR Assay and its Comparison with ELISA, Conventional RT-PCR and the Grow-out Test for Large Scale Diagnosis of Potato virus Y in Dormant Potato Tubers

Abstract

A TaqMan real-time reverse transcription-PCR (real-time RT-PCR) procedure was developed, optimized, and compared with other routine methods to detect Potato virus Y (PVY) in dormant potato tubers. Three pairs of primers and probes were designed and evaluated for their suitability to facilitate the real-time RT-PCR detection of PVY for all strain groups including PVY^O, PVY^N, PVY^N:O (= PVY^N-Wi) and PVY^NTN. Among the primer and probe combinations tested, the combination PVY-1 produced the lowest threshold cycle (Ct) value of 25.75. The procedure was further optimized by adjusting various parameters including primer/probe concentration, reaction volume, amplification cycles, and master mixes from different sources. The real-time RT-PCR was then employed to detect PVY from dormant tubers of different cultivars and potato fields, and the results were compared with those obtained from conventional RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on sprouts and grow-out testing. Out of 1,069 single-virus infected (PVY only) tubers tested, both formats of RT-PCR detected PVY in 52 samples, ELISA on sprouts in 45, ELISA on leaves in 54 and visual observations in 53. However, in 61 multiple-virus infected tubers tested, both formats of RT-PCR, and ELISA on both sprouts and leaves detected a similar number of positives, thus, making all the methods equally sensitive. Considering that ELISA requires sprouting of dormant potato tubers for PVY testing, grow-out testing takes approximately 6–8 weeks to obtain results, and conventional RT-PCR needs post-PCR processing, real-time RT-PCR offers a speedy alternative for large scale detection of PVY from dormant tubers. The method is therefore recommended for testing of PVY in potato tubers on a commercial scale in a diagnostic laboratory.

Resumen

Se desarrolló y optimizó un procedimiento de transcripción reversa de tiempo real de TaqMan (RT-PCR de tiempo real), y se comparó con otros métodos rutinarios para detectar al virus Y de la papa (PVY) en tubérculos de papa en dormancia. Se designaron tres pares de iniciadores y sondas y se evaluaron para su conveniencia para facilitar la detección de PVY por RT-PCR de tiempo real para todos los grupos de variantes, incluyendo PVY^O, PVY^N, PVY^N:O (=PVY^N-Wi) y PVY^NTN. Entre las combinaciones probadas de iniciadores y sondas, la combinación de PVY-1 produjo el valor del ciclo del umbral más bajo (Ct) con 25.75. El procedimiento se optimizó mas adelante mediante el ajuste de varios parámetros, incluyendo la concentración iniciador/sonda, volumen de reacción, ciclos de amplificación, y muestras maestras de diferentes fuentes. Se empleó posteriormente el RT-PCR de tiempo real para detectar PVY de tubérculos en dormancia de diferentes variedades y campos de papa, y se compararon los resultados con los obtenidos por la RT-PCR convencional, la serología con enzimas conjugadas (ELISA), en pruebas de brotes y en crecimiento. De 1069 tubérculos probados infectados con un solo virus (PVY solamente), ambos formatos de RT-PCR detectaron PVY en 52 muestras, por ELISA en brotes en 45, por ELISA en hojas en 54, y por observación visual en 53. No obstante, en 61 tubérculos probados con infección múltiple de virus, los dos formatos de RT-PCR y ELISA tanto en brotes como en hojas, detectaron un número similar de positivos, por lo que todos los métodos fueron igualmente sensibles. Considerando que ELISA requiere de brotación en tubérculos en dormancia para la prueba de PVY, las pruebas en crecimiento toman aproximadamente de 6 a 8 semanas para obtener resultados, y el RT-PCR convencional necesita de un proceso post PCR, el RT-PCR de tiempo real ofrece una alternativa mas rápida para detección a gran escala del PVY de tubérculos en dormancia. De aquí que el método es recomendable para pruebas de PVY en tubérculos de papa a escala comercial en un laboratorio de diagnóstico.