Allergo Journal

, Volume 21, Issue 4, pp 249–258

Potenzial, Fallstricke und aktueller Status der molekularen Diagnostik am Beispiel der Insektengiftallergie

Authors

    • Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg
    • Institut für Biochemie und Molekularbiologie Department Chemie, Universität Hamburg
  • Simon Blank
    • Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg
  • Thilo Jakob
    • Allergieabteilung und Forschergruppe Allergologie, Universitäts-Hautklinik, Universitätsklinikum Freiburg
Übersicht Review Article

DOI: 10.1007/s15007-012-0128-2

Cite this article as:
Spillner, E., Blank, S. & Jakob, T. Allergo J (2012) 21: 249. doi:10.1007/s15007-012-0128-2

Zusammenfassung

Die molekulare Allergiediagnostik ist in den letzten Jahren von einem weitestgehend akademischen Steckenpferd zu einem essenziellen Werkzeug der modernen Diagnostik gereift. So konnte in vielen Bereichen die Diagnostik auf der Basis des klassischen Extrakts, üblicherweise eines hochkomplexen Cocktails unterschiedlichster Moleküle, um eine Vielzahl seiner Einzelallergene erweitert werden, die eine Analyse wesentlich verlässlicher, aber auch ungleich vielschichtiger machen. In wenigen Gebieten tritt dabei der Fortschritt so klar zutage wie im Bereich der Hymenopterengiftallergien.

Hymenopterengiftallergien gehören aufgrund des hohen Risikos anaphylaktischer Reaktionen mit möglicherweise fatalen Folgen zu den schwersten Hypersensitivitäten. In Westeuropa gilt dies insbesondere für die Allergien auf die Gifte der Honigbiene und der gemeinen Wespe. Obgleich für eine Vielzahl von Allergenquellen die Zusammensetzung im Detail geklärt werden konnte, waren für Hymenopterengifte lange Zeit lediglich Major-Allergene charakterisiert.

Heutzutage ist eine deutlich größere Anzahl von Allergenen identifiziert und hinsichtlich ihrer Funktion, ihrer Natur und ihres allergenen Potenzials charakterisiert. Zudem erlauben fortschrittlichere Expressionsstrategien für die rekombinante Produktion von Giftallergenen eine Modifikation der Moleküle und versprechen damit Einblicke in unterschiedliche Arten der IgE-Reaktivität und des Sensibilisierungsmusters.

Damit kann das Wissen um die Allergene im Cocktail des Hymenopterengifts und ihre molekulare Nutzung helfen, die Diagnostik zu verbessern und Instrumente zur Evaluierung und Optimierung therapeutischer Strategien bereitstellen.

Schlüsselwörter

AllergenkomponentenAllergieInsektengiftKreuzreaktivitätrekombinante AllergeneSensibilisierung

Verwendete Abkürzungen

BAT

Basophilenaktivierungstest

CCD

Cross-reactive carbohydrate determinants

CRP

Kohlenhydratreiches Protein

DPP IV

Dipeptidylpeptidase IV

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

Fuk

Fukose

GlcNAc

N-Acetylglukosamin

HRP

Meerrettichperoxidase

IgE

Immunglobulin E

IgG

Immunglobulin G

Man

Mannose

MRJP

Major royal jelly Protein

MUXF

Bromelain

MW

Molecular weight

PAGE

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PDGF

Platelet derived growth factor

sIgE

Spezifisches Immunglobulin E

TG

Trockengewicht

VEGF

Vascular endothelial growth factor

Perspectives, pittfalls and current status of molecular diagnosis in insect venom allergy

Summary

Molecular approaches in allergy diagnosis in the last years evolved from a merely academic exercise to an essential tool in modern diagnostics. Thereby, the classical diagnostics based on crude extracts, mostly a complex cocktail of a variety of different molecules, could be broadened by a plethora of single components rendering an analysis much more reliable, but also much more complex. In few areas the advancement is as evident as in hymenoptera venom allergy.

Hymenoptera venom allergy is one of the most severe hypersensitivities with regard to the high risk of anaphylactic conditions with potential fatal outcome. In Western Europe this relates primarily to allergies to venoms of the honeybee and the common yellow jacket. Although the composition of allergenic extracts has been resolved for a plethora of allergen sources in detail, only major allergens of hymenoptera venoms had been characterized.

Today an increasing number of allergens is identified, characterized regarding function and nature and assessed for allergenic potential. Moreover, advanced expression strategies for recombinant production of venom allergens allow for modification of the molecules and provide insight into different types of IgE reactivities and sensitization pattern.

The obtained knowledge about the allergens in hymenoptera venom cocktails and their molecular use can help to improve current diagnostics for hymenoptera venom allergy and serve as tools for re-evaluation and improvement of current therapeutic strategies.

Key words

Allergen componentsallergycross-reactivityinsect venomrecombinant allergenssensitization

Extrakte und Allergene

Die heutige Allergiediagnostik ist geprägt durch einen dramatischen Anstieg von Wissen und eine zunehmende Verfügbarkeit von Einzelallergenen, welche noch vor einer Dekade als solche nicht vorhersehbar war. Oftmals als Gegenpol zur klassischen, extraktbasierten Diagnostik verstanden, ist die molekulare Diagnostik heute eine Option, um auf der Basis des extraktbasierten Wissens detailliertere Informationen zu gewinnen und diese für den individuellen Patienten zu nutzen.

Gleichzeitig stellt die aktuelle Situation mit einer Vielzahl von natürlichen, aber auch rekombinanten Allergenen lediglich eine Momentaufnahme dar, die den Wissensstand und die technischen Möglichkeiten der letzten Jahre widerspiegelt. Das Verhältnis von extrakt- zu einzelallergenbasierten Ansätzen dürfte sich in der Zukunft weiter zugunsten der molekularen Diagnostik verschieben, da der Erkenntnisgewinn auf molekularer Ebene die Waagschale stetig mit neuen und interessanten Molekülen füllt.

Eine simplifizierte, aber exemplarische Quintessenz der molekularen Diagnostik gewährt z. B. der Allergen-Chip ImmunoCAP® ISAC (Thermo Scientific), der eine Fülle von Allergenen für die molekulare Diagnostik trägt. In der aktuell erhältlichen Version mit 112 Allergenen sind 50 % der Allergene rekombinanten Ursprungs und 50 % nativen Ursprungs. Extrakte hingegen sind nicht vertreten. Für die proteinbiochemisch problematischen Insektengifte sind hier lediglich vier Allergene präsent.

Generell repräsentiert die Insektengiftallergie eine der schwersten Hypersensitivitätsreaktionen und ist mit einer hohen Anaphylaxierate assoziiert. Das Vorkommen tödlicher Reaktionen macht Hymenopterengifte deutlich vor anderen Toxinen aus dem Tierreich zu den für den Menschen bedrohlichsten Giften überhaupt. Trotz dieser Datenlage ist die Natur bekannter und neuer Komponenten nicht geklärt. Zudem sind Methoden zu ihrer rekombinanten Produktion, ihrer posttranslationalen Definition und Implementierung in moderne diagnostische Verfahren nach wie vor nicht adäquat realisiert. Die Nutzung von krudem Gift für Diagnostik und Therapie von Insektengifthypersensitivitäten ist zudem mit signifikanten Nachteilen assoziiert, die auf der Vernachlässigung der Zusammensetzung der Gifte und der Relevanz von Minor-Allergenen für die Pathogenese, das klinische Erscheinungsbild, die Diagnose und die therapeutische Effizienz beruhen.

Klassisch werden zur Diagnostik (und Therapie) aufgearbeitete Rohgifte eingesetzt, die durch unterschiedliche mechanische und manuelle Verfahren isoliert werden. Parallel zu diesen klassischen Extrakten wurden schon seit einiger Zeit gereinigte Allergene wie das native Api m 1 für eine molekulare Diagnostik eingesetzt, was aber weniger eine molekulare als eine Surrogatstrategie darstellt. Eine praktikable Komponentenauflösung lässt sich auch durch Separation der natürlichen Komponenten, z. B. durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese(PAGE)-Verfahren realisieren (wie das ehem. AlaBLOT™-System, Siemens Healthcare Diagnostics). Hierbei ist jedoch zu bedenken, dass eine Interpretation nur bekannte Proteine einschließen kann und Überlagerungen durch unbekannte Vertreter nicht verlässlich vermieden werden können.

Hymenopterengiftallergene

Die generelle Problematik solcher Ansätze lässt sich idealerweise durch die Betrachtung der allergologisch relevanten Giftkomponenten der Honigbiene (Apis mellifera) und der gemeinen Wespe (Vespula vulgaris), den hierzulande entscheidenden Hymenopterenspezies, verdeutlichen, wie sie heute bekannt bzw. in den Allergendatenbanken vertreten sind (Tabelle1).
Tabelle 1

Übersicht über die bekannten Bienengift- und Wespengiftallergenea

Allergen

Name/Funktion

MW (kDa)

% TG

potenzielle N-Glykosylierung

bakterielle Expression

eukaryotische Expression

BAT

Bienengiftallergene

Api m 1

Phospholipase A2

17

12

1

+

+

+

Api m 2c

Hyaluronidase

45

2

3

+

+

+

Api m 3

Saure Phosphatase

49

1–2

2

 

+

+

Api m 4

Melittin

3

50

-

 

-

 

Api m 5d

Allergen C/DPP IV

100

<1

6

 

+

+

Api m 6

Proteaseinhibitor

8

1–2

-

 

+

 

Api m 7f

Protease

39

?

3

 

+

 

Api m 8

Carboxylesterase

70

?

4

 

+

 

Api m 9

Carboxypeptidase

60

?

4

 

+

 

Api m 10

CRP/Icarapin

55

<1

2

+

+

+

Api m 11.0101

MRJP 8

65

?

6

 

+

 

Api m 11.0201

MRJP 9

60

?

3

 

+

 

Api m 12e

Vitellogenin

200

?

1

 

+

 

Wespengiftallergene

Ves v 1

Phospholipase A1

35

6–14

-

 

+

+

Ves v 2.0101c

Hyaluronidase

45

1–3

4

+

+

 

Ves v 2.0201c

Hyaluronidaseb

45

?

2

 

+

 

Ves v 3d

DPP IV

100

?

6

 

+

+

Ves v 5

Antigen 5

25

5–10

-

+

+

+

Ves v 6e

Vitellogenin

200

?

4

 

+

 

BAT: Basophilenaktivierungstest; CRP: Carbohydrate-rich protein; DPP IV: Dipeptidylpeptidase IV; MRJP: Major royal jelly protein; MW: Molecular weight; TG: Trockengewicht

aSpeziesspezifische Allergene sind in Standardschrift und bekannte kreuzreaktive Allergene kursiv dargestellt.binaktiv; c,d,ekreuzreaktive Allergene; fEine homologe Protease im Wespengift sowie weitere Proteasen im Bienengift wurden identifiziert, die aber noch nicht als Allergene beschrieben sind.

Die am besten bekannten Bienengiftallergene umfassen die Phospholipase A2 (Api m 1), die Hyaluronidase (Api m 2) und das aus 26 Aminosäuren bestehende basische Peptid Melittin (Api m 4) [2], die mit 12 %, 2 % und 50 % des Trockengewichts Proteine mittlerer bis hoher Konzentration darstellen [26]. Klassische Allergene des Wespengifts sind die Phospholipase A1 (Ves v 1), die Hyaluronidase (Ves v 2) und das Antigen 5 (Ves v 5) [22], dem bisher keine Funktion zugeordnet werden konnte.

In den letzten Jahren wurden jedoch signifikante Fortschritte bei der Identifizierung neuer, oft gering konzentrierter Moleküle gemacht, denen wiederum zum Teil schon lange allergenes Potenzial zugeordnet werden konnte. So konnte das Gen der sauren Phosphatase des Bienengifts (Api m 3) identifiziert und das Protein rekombinant hergestellt werden [2, 11]. Mit der Identifizierung des 100-kDa-Allergen-C (Api m 5) des Bienengifts sowie seines Homologs im Wespengift, Ves v 3, als Dipeptidylpeptidasen IV konnte eine neue Klasse von Hymenopterengiftenzymen beschrieben werden [3, 14]. Im Wespengift wurde zusätzlich zur klassischen Hyaluronidase (Ves v 2.0101) eine inaktive Isoform (Ves v 2.0201) identifiziert [24], die eine inaktivierende Mutation im aktiven Zentrum aufweist und die dominierende Isoform im Gift zu sein scheint. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es sich bei Api m 10 (kohlenhydratreiches Protein, Icarapin) um ein neues Major-Allergen des Bienengifts sowie ein Allergen mit möglicherweise großer Bedeutung für diagnostische und therapeutische Anwendungen handelt [5]. Andere Immunglobulin-E(IgE)-bindende Proteine des Bienengifts umfassen einen putativen Proteaseninhibitor (Api m 6) [21], eine Protease (Api m 7) [37], eine Esterase (Api m 8) und eine Peptidase (Api m 9), deren Relevanz Gegenstand derzeitiger Untersuchungen ist. Als neueste Allergene sind u. a. die zwei „Major royal jelly“-Proteine (MRJP) 8 und 9 (zwei Isoformen des Api m 11) des Bienengifts [6] sowie als neue Panallergene das Vitellogenine, Api m 12 und Ves v 6 (Manuskript eingereicht), zu nennen.

An dieser Stelle sei auch erwähnt, dass nahezu alle und insbesondere die neueren Allergene Glykoproteine sind, die eigene Schwierigkeiten mit sich bringen.

Neben diesen Komponenten mit dokumentierter allergener Natur konnten in jüngster Zeit einige weitere Komponenten wie z. B. ein C1q-ähnliches Protein [10], ein PDGF/VEGF(„platelet derived growth factor/vascular endothelial growth factor“)-ähnliches Protein [30] und Hexamerin [31] identifiziert werden, deren allergene Natur jedoch noch zu evaluieren bleibt. Ihr geringer Anteil am Gift wird auch hier eine rekombinante Zugänglichkeit erfordern.

Dank der zunehmenden Anwendung proteomischer und genomischer Ansätze ist für die Zukunft mit Sicherheit davon auszugehen, dass die Zahl relevanter identifizierter Allergene in Hymenopterengiften signifikant ansteigen wird. Welche Anzahl und insbesondere welche konkreten Allergene für eine molekulare Diagnostik essenziell und sinnvoll sein werden — speziell die speziesspezifischen oder eher anhand ihrer IgE-Reaktivität ausgewählten Vertreter — und in welcher Form sie zum Einsatz kommen sollten, ist zum jetzigen Zeitpunkt allerdings noch nicht abzusehen.

Anfänge der molekularen Diagnostik der Hymenopterengiftallergie

Bis in jüngste Zeit war nur eine außerordentlich stark begrenzte Anzahl von Giftallergenen, so z. B. Api m 1, Api m 4 und Ves v 5 als native oder rekombinante Äquivalente verfügbar [23, 28]. Ihre Nutzung und damit die gegebene Möglichkeit, Analysen auf molekularer Ebene zu realisieren, brachten eine gewisse Verbesserung der Diagnostik mit sich [17, 27].

Prinzipiell gelten jedoch für die Isolierung bzw. Herstellung von Giftallergenen grundsätzliche Probleme und Erwägungen. Eine Reinigung nativer Proteine aus dem Gift ist, wenn überhaupt, nur für ausreichend vorhandene Proteine sinnvoll (Api m 1, Api m 4, Ves v 1, Ves v 5). Dennoch ist gerade hier das Risiko verbleibender Komponenten, die das Bild auf molekularer Ebene verfälschen, gegeben. So ist z. B. eine Abtrennung von Api m 4 als dominante Komponente des Bienengifts schwierig.

Bei einer rekombinanten Expression besteht dieses Problem nicht; Schwierigkeiten liegen vielmehr in einer adäquaten Umsetzung der Produktion. Für erste Expressionen von Insektengiftallergenen wurde auf das bakterielle Expressionssystem zurückgegriffen, das sicherlich dafür prädestiniert ist, einfach und schnell große Mengen an Protein zu erhalten. Allerdings gilt es, neben einer effizienten Produktion authentische Faltung und Immunoreaktivität der Allergene zu gewährleisten. Ihre toxischen Eigenschaften und enzymatischen Aktivitäten beeinflussen jedoch die Effizienz der Expression und die Eigenschaften der resultierenden rekombinanten Allergene. Dennoch konnten ausgewählte Insektengiftallergene, meist für strukturelle Analysen, funktionell in Bakterien produziert werden (Tabelle1) [8, 9, 13, 25, 35, 36]. Die Effizienz dieser Verfahren ist jedoch häufig durch die Notwendigkeit extensiver Faltungsschritte beeinträchtigt und die Anwendung auf strukturell vergleichsweise einfache und kleine Moleküle beschränkt.

Insgesamt gilt, dass eine Reinigung nur bedingt und eine bakterielle Expression nur für wenige, bevorzugt nicht glykosylierte Allergene niederen Molekulargewichts sinnvoll ist.

Rekombinante Allergene aus Eukaryoten

Eukaryotische Zellen wachsen langsamer und mit geringeren Proteinausbeuten, hinterlassen jedoch auf dem Protein unveränderliche Spuren in Form posttranslationaler Modifikationen. Im Gegensatz zu Escherichia (E.) coli addieren Eukaryoten wie Hefen und insbesondere auch Insektenzellen und Säugerzellen Oligosaccharide, die bei ähnlicher Grundstruktur dem nativen, glykosylierten Allergen näher kommen, aber dennoch deutliche Varianzen aufweisen und neben der Faltung auch die Immunoreaktivität beeinflussen [36]. Da die meisten IgE-Epitope konformationeller Natur zu sein scheinen und eine intakte Oberfläche voraussetzen, ist diese Art der Allergenexpression für diagnostische Zwecke vorzuziehen, da für die Ausbildung der korrekten dreidimensionalen Struktur vieler eukaryotischer Proteine posttranslationale Modifikationen essenziell sind.

Obgleich früh erkannt [36], konnten in den letzten Jahren für Insektengiftallergene insbesondere die Expression in Insektenzellen als geeignetes System etabliert und die Funktionalität der Proteine, die Epitopauthentizität und die korrekte Faltung resultierender Proteine demonstriert werden (Tabelle1) [3, 32, 36]. Als ein Indiz für letztere kann die enzymatische Aktivität (sofern vorhanden) angesehen werden, wie sie für in Insektenzellen produzierte Phospholipase A1 (Ves v 1) [33], Hyaluronidasen (Api m 2, Ves v 2) [32, 36] und Dipeptidylpeptidasen IV (Api m 5, Ves v 3) [3] nachgewiesen werden konnte.

Als weiteres Beispiel für die Stärke rekombinanter Verfahren kann hier wiederum das Api m 1 angeführt werden. In der Natur als Gemisch mehrerer Glykoformen vorliegend, zeigt eine Expression von Api m 1 in E. Coli ein vollständig homogenes Protein. Eine Expression in Eukaryoten zeigt ein heterogenes Gemisch von auch natürlich vorliegenden Glykoformen, die bei Bedarf gezielt produziert werden können [4]. Eine Deletion der Glykosylierungsposition führt hier erneut zu einem homogenen Protein. Unterschiedliche Varianten dieser Formen sind oder werden kommerziell verfügbar sein; welche Variante ein optimales Äquivalent des nativen Allergens darstellt, liegt in der klinischen Fragestellung begründet.

Molekulare Diagnostik zur Abgrenzung von Doppelsensibilisierungen

Neben einer echten Doppelsensibilisierung gegen Bienen- und Wespengift können in der extraktbasierten In-vitro-Allergiediagnostik Kreuzreaktivitäten zu falsch-positiven Testergebnissen führen. Dieses Phänomen kann zum einen auf gemeinsamen Proteinepitopen homologer Allergene beider Gifte beruhen, wie für die Hyaluronidasen (Api m 2, Ves v 2) und Dipeptidylpeptidasen (Api m 5, Ves v 3) beschrieben und wahrscheinlich für die neu identifizierten 200-kDa-Allergene (Api m 12, Ves v 6), die in beiden Giften vorkommen. Zum anderen kann jedoch ein Großteil der Kreuzreaktivitäten auf IgE-Antikörper zurückgeführt werden, die gegen kreuzreaktive Glykosylierungen („cross-reactive carbohydrate determinants“, CCD) der Allergene gerichtet sind [1, 12, 18]. Dies ist von besonderer Bedeutung, da die meisten Bienen- und Wespengiftallergene Glykoproteine mit einer bis mehrerer solcher Kohlenhydratstrukturen darstellen (Tabelle1).

Verantwortlich sind IgE-Antikörper gegen einen α1,3-verknüpften Fukoserest der insektenspezifischen (bei Pflanzen auch gegen β1,2-Xylose) Glykosylierung (Abb.1a). Solche xenobiotischen Modifikationen stellen hoch immunogene Epitope dar, die sowohl spezifische Immunglobulin G(IgG)- als auch IgE-Antikörper induzieren können [19].

https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1007%2Fs15007-012-0128-2/MediaObjects/15007_2012_128_Fig1_HTML.jpg

Abb. 1: Kreuzreaktive Kohlenhydratdeterminanten (CCD) im Bienen- und Wespengift und ihr Einfluss auf sIgE-Reaktivitäten. a: Vereinfachte, exemplarische Darstellung der „Core“-Glykosylierung von Säugern wie dem Menschen im Vergleich zu xenobiotischer Glykosylierung von Insekten und Pflanzen. Diese trägt einen zusätzlichen α1,3-verknüpften Fukoserest sowie bei Pflanzen einen β1,2-verknüpften Xyloserest (GlcNAc: N-Acetylglukosamin; Man: Mannose; Fuk: Fukose). b: Stark variante Verteilung von hoch und gering vorkommenden Komponenten des Bienen- und Wespengifts in einer gelelektrophoretischen Analyse. c: Exemplarische sIgE-Reaktivität eines CCD („cross-reactive carbohydrate determinants“)-positiven Serums mit Bienen-, Wespen- und Hornissengift im Immunoblot. d: sIgE-Reaktivität eines CCD-positiven Serums und dem Serum eines Bienengift-Allergikers mit rekombinantem Api m 3 aus {tiSpodoptera frugiperda und Trichoplusia (T.) ni} Insektenzellen im ELISA („enzyme linked immunosorbent assay“). Im Gegensatz zur ausgeprägten CCD-Reaktivität von in T. ni Insektenzellen hergestelltem Api m 3 ist diese bei in Sf9-Zellen hergestelltem Api m 3 immunologisch nicht nachweisbar.

Gegen das Fukoseepitop gerichtete IgE-Antikörper sind für etwa 75% der in In-vitro-Tests diagnostizierten Doppelsensibilisierungen gegen Bienen- und Wespengift verantwortlich [18], was die Wahl der geeigneten therapeutischen Intervention in vielen Fällen erschwert. Die klinische Relevanz derartiger IgE-Antikörper wird kontrovers diskutiert, scheint aber im Fall der Insektengiftallergie gering zu sein. Nichtsdestoweniger haben schwere anaphylaktische Reaktionen gegen das α-Gal-Epitop (Galaktose-α1,3-Galaktose) bei Gabe des therapeutischen Antikörpers Cetuximab (Erbitux®) [7] und bei Allergien gegen rotes Fleisch gezeigt, dass Kohlenhydratstrukturen erhebliche systemische Reaktionen auslösen können.

Ungeachtet dessen stellen Anti-CCD-IgE ein unbestrittenes Problem der In-vitro-Allergiediagnostik dar, da sie zu multiplen Reaktivitäten mit jeglichen glykosylierten Pflanzen- (Nahrungsmittel, Pollen) als auch Insektengiftallergenen führen und so klinisch relevante Sensibilisierungen gegen Proteinepitope überlagern (Abb.1b, c). Zum Nachweis solcher CCD-spezifischer Antikörper stehen mittlerweile unterschiedliche Reagenzien zur Verfügung (Bromelain, MUXF; Meerrettichperoxidase, HRP; Askorbatoxidase), die allerdings eher als phänomenologischer Indikator denn als exakte Glykanstruktur zu betrachten sind und ebenfalls keine Schlussfolgerung über die Relevanz anderer Sensibilisierungen erlauben.

Die Verwendung glykosylierter, speziesspezifischer Allergene wie z. B. Api m 1 (Tabelle1) ist nur eine scheinbare Lösung und die Deletion von Glykosylierungsstellen — wie hier im kommerziellen Produkt realisiert — scheidet bei Proteinen mit multiplen Glykanen wie Api m 3 oder Api m 5 alleine aus praktischen Gesichtspunkten de facto aus.

Gerade in diesem Bereich verfügt die molekulare Allergiediagnostik der Insektengiftallergie mit rekombinanten Allergenen über ein erhebliches Potenzial. So resultiert die Verwendung von Sf9-Insektenzellen aus Spodoptera frugiperda als Expressionssystem in Allergenen, die unter Beibehaltung einer funktionellen Glykosylierung, korrekter Faltung und einem vollständigen Epitopspektrum keine immunologisch nachweisbare CCD-Reaktivität zeigen (Abb.1d). Dieses Phänomen geht offensichtlich auf die spezifische Vermeidung der α1,3-Core-Fukosylierung zurück [32]. Andere Insektenzellen wiederum, wie z. B. solche aus Trichoplusia ni, können exakt den authentischen Phänotyp inklusive CCD-Reaktivität prägen, was bei eventuellem Bedarf an naturidentischen Allergenen und für funktionelle Studien der Glykane interessant werden kann.

Bisher hat sich die molekulare Diagnostik primär unter Nutzung nicht-CCD-reaktiver speziesspezifischer Allergene wie Ap1 m 1 und Ves v 5 als nützlich bei der Unterscheidung von echter Doppelsensibilisierung und Kreuzreaktivität erwiesen [15, 16, 29]. Dieses Potenzial kann in der Zukunft sowohl durch zusätzliche speziesspezifische als auch kreuzreaktive, aber CCD-freie Allergene weiter ausgeschöpft werden, wie eine exemplarische Analyse individueller Reaktivitätsprofile auf der Basis sowohl herkömmlicher, extraktbasierter als auch einzelallergenbasierter Verfahren zeigt (Tabelle2).
Tabelle 2

Beispiele für sIgE-Reaktivitätsprofile der extrakt- und allergenbasierten Diagnostik der Insektengiftallergie

Diagnostik

Patienten sIgE

 

1

2

3

4

5

6

7

Extrakt-basiert

BG

+

+

+

+

+

+

-

WG

+

+

+

+

-

+

-

Allergen-basiert

Api m 1

+

-

-

+

-

+

-

Api m 2

-

+

-

+

+

+

-

Api m 3

+

-

-

+

-

+

+

Api m 4

+

-

-

-

+

+

-

Api m 5

-

-

-

+

-

+

-

Api m 10

+

+

-

+

+

+

+

Ves v 1

-

-

+

+

-

+

-

Ves v 5

-

-

+

+

-

+

-

CCD

+

+

+

+

-

+

-

Relevantes Insekt

B

B

W

B/W

B

B/W

B

B: Biene; BG: Bienengift; sIgE: spezifisches Immunglobulin E; W: Wespe; WG: Wespengift

Weiterhin erlauben CCD-frei hergestellte korrekt gefaltete Allergene erstmals die Beurteilung ihrer Relevanz unabhängig von ihrer natürlichen Glykosylierung unter Umgehung aufwendiger Inhibitionsanalysen. So konnten wir unter Verwendung von CCD-freiem, korrekt gefaltetem Ves v 2.0101 und Ves v 2.0201 die klassische Rolle der Hyaluronidasen als Major-Allergen des Wespengifts klar widerlegen [32], eine Einschätzung, die von anderen bestätigt wurde [20, 34]. Im Gegenzug konnten für stark glykosylierte Proteine eine ausgeprägte IgE-Reaktivität und klinische Relevanz gezeigt werden [3, 5]. Insgesamt konnten in dieser Weise für alle bekannten Allergene der Honigbiene und der gemeinen Wespe spezifische IgE-Reaktivitäten nachgewiesen werden (Tabelle1).

Die Verwendung solcherart definierter rekombinanter Moleküle, die nicht die natürliche, aber die diagnostisch bzw. klinisch relevante IgE-Reaktivität widerspiegeln, wird zukünftig ein neues Licht auf die Bedeutung einzelner Allergene sowie der Gesamtsensibilisierungsprofile werfen.

Molekulare Diagnostik bei negativem oder geringem sIgE

Ein relevantes Problem der In-vitro-Diagnostik der Insektengiftallergie unter Verwendung von Giftextrakten stellen Patienten dar, die trotz nachgewiesener Symptomatik negative Testergebnisse zeigen. Eine mögliche Ursache hierfür ist, dass Giftextrakte heterogene Gemische darstellen, in denen die verschiedenen Komponenten in stark unterschiedlichen Konzentrationen vorkommen und einzelne Allergene bei der Verarbeitung zudem verloren gehen oder degradiert werden können [5]. So kann in der Diagnostik leicht eine Verschiebung der Information zugunsten überwiegend vorhandener Allergene wie Api m 1 und Api m 4 auftreten. Patienten, die gegen gering vorhandene Allergene, wie z. B. Api m 10, sensibilisiert sind, können so der extraktbasierten Diagnostik entgehen (Tabelle2, Patient 7).

Ein weiteres Problem scheint aus der geringeren Reaktivität einzelner Allergene im Kontext des Extrakts zu erwachsen, so z. B. Ves v 5, was in einer scheinbar geringeren Gesamtreaktivität resultieren würde [16].

Diese und viele andere Probleme können mit der molekularen Diagnostik unter Nutzung reiner rekombinanter Allergene, die zudem quantitativ nicht limitiert und damit analytisch besser zugänglich sind, umgangen werden. Unabhängig hiervon konnten zelluläre diagnostische Verfahren wie der Basophilenaktivierungstest Informationen auf molekularer Ebene liefern und damit die vielfältige Einsetzbarkeit rekombinanter Allergene unterstreichen.

Perspektiven

Die bereits jetzt greifbare molekulare Diagnostik im Bereich der Hymenopterengiftallergien bietet elegante Strategien zur Unterscheidung von genuiner Doppelsensibilisierung und Kreuzreaktivität sowie zur Vermeidung von Reaktivitätsverschiebungen zugunsten weniger relevanter Allergene in Extrakten. Unter Verwendung eines wachsenden Panels CCD-freier speziesspezifischer und homologer rekombinanter Allergene wird die molekulare Diagnostik zunehmend die Erstellung individueller Sensibilisierungsprofile von Patienten ermöglichen. Diese beinhaltet das Potenzial, Therapieverläufe detailliert zu verfolgen, therapieinduzierte Neusensibilisierungen zu erkennen, Möglichkeiten zur Anpassung therapeutischer Interventionen und vielleicht auch prognostische Optionen zu entwickeln. Mit diesen Fortschritten betritt auch die Diagnostik der Hymenopterengiftallergie endgültig das Zeitalter der molekularen Diagnostik.

Molekulardiagnostik und Insektengiftallergie

Welche der folgenden Allergene des Bienen- und Wespengiftes zeigen Kreuzreaktivität auf Proteinebene?
  • Phospholipasen

  • Dipeptidylpeptidasen

  • Saure Phosphatasen

  • Antigen 5

  • Major Royal Jelly Proteine

Welcher der folgenden Wirtsorganismen führt keine posttranslationalen Modifikationen von Allergenen in Form von Glykosylierungen durch?
  • Hefen

  • Säugerzellen

  • Insektenzellen

  • E. coli

  • Pflanzen

Welche der folgenden Modifikationen ist verantwortlich für Carbohydrat-basierte Kreuzreaktivität von Insektengiftallergenen?
  • β1,2-Xylose

  • α1,3-Galaktose

  • α1,3-Fukose

  • α1,6-Fukose

  • α1,3-Mannose

Welches der folgenden Moleküle ist nicht zum Nachweis Carbohydrat-basierter Kreuzreaktivität geeignet?
  • Meerrettichperoxidase

  • MUXF

  • Bromelain

  • Askorbatoxidase

  • Antigen 5

Bei welchem der folgenden Allergene handelt es sich nicht um ein Spezies-spezifisches Allergen?
  • Phospholipase A1

  • Phospholipase A2

  • Hyaluronidase

  • Antigen 5

  • Melittin

Welche der folgenden Aussagen zur Carbohydrat-basierten Kreuzreaktivität von Bienen- und Wespengift ist richtig?
  • Eine Diagnostik unter Nutzung von Bienen- und Wespengift sowie eines CCD-Markers erlaubt die Identifizierung des für den Patienten relevanten Insekts.

  • Die Höhe des spezifischen IgE gegen Bienen- und Wespengift erlaubt die Identifizierung des für den Patienten relevanten Insekts.

  • Eine Diagnostik unter Nutzung Spezies-spezifischer, nicht-glykosylierter Allergene erlaubt die Identifizierung des für den Patienten relevanten Insekts.

  • Bei Vorhandensein von anti-CCD IgE ist in keinem Fall die Identifizierung des für den Patienten relevanten Insektes möglich, sodass eine Therapie mit beiden Giften eingeleitet werden sollte.

  • Anti-CCD IgE gegen Insektengifte sind klinisch hoch relevant und es sollte bei ihrem Vorhandensein in jedem Fall eine Therapie mit beiden Giften eingeleitet werden.

Nach einer anaphylaktischen Reaktion auf den Stich eines nicht identifizierten Insekts stellt sich eine 40-jährige Patientin in Ihrer Sprechstunde vor. Die In-vitro-Diagnostik zeigt positive Testergebnisse auf Bienengift, Wespengift, CCDs sowie auf Ves v 5 (Antigen 5) und ein negatives Ergebnis auf Api m 1 (Phospholipase A2) und Ves v 1 (Phospholipase A2). Welche Therapie würden Sie aufgrund dieses Befundes einleiten?
  • Die Patientin zeigt eine Sensibilisierung gegen Bienengift, sodass eine Therapie mit Bienengift ausreichend ist.

  • Die Patientin zeigt eine Sensibilisierung gegen Wespengift, sodass eine Therapie mit Wespengift ausreichend ist.

  • Die Patientin zeigt eine Doppelsensibilisierung gegen Bienen- und Wespengift, sodass eine Therapie mit beiden Giften erfolgen sollte.

  • Der positive in vitro Test auf Ves v 5 besitzt keine Aussagekraft, da ein homologes Protein im Bienengift vorhanden ist. Die Therapie sollte mit beiden Giften erfolgen.

  • Ausschließlich ein positiver In-vitro-Test mit zwei Spezies-spezifischen Allergenen erlaubt eine Aussage über das für die Patientin relevante Insekt. Die Therapie sollte mit beiden Giften erfolgen.

Welche der Aussagen zur Extrakt-basierten In-vitro-Diagnostik der Bienen- und Wespengift-Allergie ist falsch?
  • Einzelne Allergene können bei der Verarbeitung von Giftextrakten verloren gehen, sodass Patienten, die gegen gering vorhandene Allergene sensibilisiert sind, der Extraktbasierten Diagnostik entgehen können.

  • Einzelne Allergene können im Kontext des Extraktes eine geringere Reaktivität aufweisen, was in einer scheinbar geringeren Gesamtreaktivität resultieren kann.

  • Die Extrakt-basierte Diagnostik kann von anti-CCD IgE beeinträchtigt werden, was die Unterscheidung von genuiner Doppelsensibilisierung und Kreuzreaktivität erschwert.

  • Die Extrakt-basierte Diagnostik kann durch homologe Allergene, die in beiden Giften vorkommen, beeinträchtigt werden, was die Unterscheidung von genuiner Doppelsensibilisierung und Kreuzreaktivität erschwert.

  • Die wichtigen Allergene sind in den Giftextrakten in ungefähr gleichen Mengen vorhanden, sodass keine Verschiebung der Informationen zugunsten überwiegend vorhandener Allergene auftreten kann.

Welche Aussage über rekombinante Allergene ist falsch?
  • In Bakterien hergestellte Allergene weisen in der Regel das volle Epitopspektrum nativer Allergene auf.

  • Durch Herstellung von Allergenen in unterschiedlichen Insektenzelllinien lassen sich differenziell glykosylierte Allergene mit unterschiedlicher CCD-Reaktivität herstellen.

  • Posttranslationale Modifikationen sind in vielen Fällen essenziell für die Ausbildung der korrekten dreidimensionalen Struktur von Allergenen.

  • Eukaryotische Zellen wie Insekten-, Säuger- und Hefezellen führen posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen und das Einführen von Disulfidbrücken durch.

  • Die von unterschiedlichen Zelllinien durchgeführten posttranslationalen Modifikationen von Allergenen können variieren und so deren Immunoreaktivität beeinflussen.

Welches der folgenden Allergene ist von Natur aus nicht glykosyliert und könnte so auch in nativer Form zur Diagnostik unter Umgehung von CCD-Reaktivität eingesetzt werden?
  • Api m 1

  • Ves v 2

  • Api m 3

  • Ves v 5

  • Api m 5

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