Date: 17 Oct 2012

Analisi di Melt ad alta risoluzione (High Resolution Melt Analysis, HRMA): nuovo metodo di screening per il gene PKD2 in famiglie con malattia autosomica dominante del rene policistico

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Riassunto

Premesse

La malattia autosomica dominante del rene policistico è la principale causa genetica di insufficienza renale cronica e presenta un’incidenza di circa 1:1000 nati vivi. è riconducibile per l’85% a mutazioni in PKD1 e per il restante 15% in PKD2. L’ADPKD è caratterizzata da reni bilateralmente ingranditi e numerose cisti. Attualmente, l’ecografia è il metodo di screening preferenzialmente utilizzato per la diagnosi di ADPKD. Poiché la formazione delle cisti renali è un processo etàdipendente, la diagnosi ecografica può produrre risultati falsi negativi in soggetti giovani. Di conseguenza, il test genetico risulta un valido aiuto nei casi in cui la diagnostica per immagine non sia chiara, in particolar modo nei soggetti giovani e nello screening dei potenziali donatori consanguinei. Questo lavoro propone la messa a punto di un metodo di screening genetico basato sull’analisi di Melt ad alta risoluzione (HRMA) del gene PKD2.

Metodi

L’HRMA consiste nell’amplificazione della sequenza di interesse in presenza di un fluoroforo che si intercala al DNA a doppio filamento e sfrutta la diversa temperatura di Melt delle sequenze nucleotidiche e il loro differente comportamento di dissociazione, durante la denaturazione termica. Ogni amplicone è caratterizzato da un andamento e una temperatura di Melt caratteristici e sequenza-specifici; pertanto, amplificati che differiscono nella loro sequenza sono caratterizzati da profili diversi che li rendono distinguibili e permettono l’individuazione di variazioni.

Per ciascun amplicone di PKD2 si sono messi a punto le condizioni di amplificazione e il range di analisi HRM, in modo da individuare le condizioni migliori, le più riproducibili e le maggiormente utili ed efficaci per la ricerca di mutazione e lo studio di polimorfismi.

Risultati

Sperimentalmente, la messa a punto delle condizioni ottimali è stata eseguita valutando complessivamente i dati eseguendo l’analisi su controlli sani wildtype, precedentemente sequenziati. Durante la fase di messa a punto si sono valutati: il livello di amplificazione, la quantità e la qualità di amplificato prodotto, ovvero l’assenza di aspecifici di amplificazione e l’unicità del picco di Melt.

Tutte le dodici variazioni precedentemente identificate tramite il sequenziamento diretto sono state rivelate e individuate anche dall’analisi con HRM, evidenziando una concordanza del 100% tra i due metodi.

Conclusioni

Dal nostro punto di vista e sulla base dei risultati ottenuti, si può concludere che l’analisi con HRM può essere considerata un ottimo strumento di screening per la ricerca di mutazioni per il gene PKD2, in quanto presenta facilità nella preparazione dei campioni, velocità di analisi, costo ridotto, efficacia, sensibilità e specificità idonee per la ricerca di varianti note e non note in questo gene.

Summary

Background

ADPKD is an inherited condition caused by mutations at two genes (PKD1 and PKD2).PKD1 is a GC-rich gene, consists of 46 exons, with exons 1—33 duplicated as 6 duplicons on chromosome 16; PKD2 is a single copy gene and consists of 15 exons. Thegenetic diagnosis of ADPKD is challenging because of the genetic heterogeneity and marked allelic heterogeneity at ADPKD genes, with the majority of mutations being private to a single family. Hence, complete analysis of both genes is typically required in each patient. Several screening methodologies have been used to characterize the PKD genes, including Single-Strand Conformation Analysis, Denaturing High-Pressure Liquid Chromatography, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, and Direct Sanger Sequencing. In this study, we explored the utility and robustness of High Resolution Melt (HRM) as a tool for mutation analysis of the PKD2 gene in ADPKD families.

Method

The method is based on DNA amplification in the presence of a double stranded DNA (dsDNA) intercalating fluorescent dye and on the transition of the double-stranded DNA molecule to its two single strands. DNA denaturation or melting has been used for many years to study DNA structure and composition. Initially, fluorescence is high in a Melt analysis because the sample starts as dsDNA, but fluorescence increases as the temperature is raised and DNA dissociates into single strands. The observed melting behavior, typical of each sample, can be discriminated according to sequence and length. Amplification and HRM conditions for 15 fragments of the PKD2 gene were optimized. HRM analysis were performed with the Rotor-Gene 6000 (Qiagen). Regions where the patient and control samples produce a common profile were not further evaluated, while those regions where the patient profile deviates from the control were assessed by DNA sequencing. For HRM development and validation purposes, we have utilized 12 PKD2 variants previously identified by Direct Sanger sequencing.

Results

Aberrant HRM melting profiles indicative of the underlying PKD2 sequence variant used as control were observed for all 12 variants used. We developed a screening method using HRM analysis prior to direct sequencing, where only positive samples (according to reference) are further sequenced. With this approach, all positive and negative patients were successfully distinguished, and the results obtained were in absolute concordance with the direct sequence analysis.

Conclusion

We have developed a strategy for rapid molecular mutation analysis of the PKD2 gene in ADPKD families, which utilizes a HRM-based prescreening followed by Direct Sanger Sequencing of amplicons with abnormal melting profiles. This is a simple and good technique for PKD2 genotyping and may significantly reduce the time and the cost for molecular diagnosis in ADPKD.