Der Ophthalmologe

, Volume 107, Issue 10, pp 937–940

Alkylphosphocholine hemmen die Proliferation und Anhaftung von Linsenepithelzellen

Authors

  • R. Liegl
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
  • M. Kernt
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
  • K. Obholzer
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
  • A. Wolf
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
  • R. Schumann
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
  • C. Haritoglou
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
  • A. Kampik
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
    • Augenklinik der LMU München, Campus Innenstadt
Originalien

DOI: 10.1007/s00347-010-2128-5

Cite this article as:
Liegl, R., Kernt, M., Obholzer, K. et al. Ophthalmologe (2010) 107: 937. doi:10.1007/s00347-010-2128-5

Zusammenfassung

Ziel

Der Nachstar ist die häufigste Komplikation nach erfolgreicher Kataraktchirurgie. 10 Jahre nach Operation benötigen bis zu 42% der Patienten mit Acryllinsen und scharfer Kante eine Nd:YAG-Kapsulotomie. Akkomodative und multifokale Intraokularlinsen weisen zum Teil sogar noch höhere Nachstarraten auf. Eine pharmakologische Prophylaxe mit Alkylphosphocholinen (APC) könnte eine effektive Alternative darstellen.

Methode

Als In-vitro-Modell diente die humane Linsenepithelzelllinie HLE-B3. Nach Inkubation mit APC in unterschiedlichen Konzentrationen (0,01; 0,1 und 1 mM) in Gegenwart von 5% Serum erfolgten der Trypanblau-Ausschlusstest und der Live/Dead-Test. Die Proliferation der Zellen wurde mit dem Tetrazoliumreduktionsassay bestimmt. Die Untersuchung der Anhaftung der Zellen wurde mittels mit Fibronektin und erstmals auch mit Laminin beschichteten Platten durchgeführt.

Ergebnisse

APC können die Proliferation von humanen Linsenepithelzellen in Gegenwart von nur 5% Serum dosisabhängig hemmen. Die Proliferation wurde zu mehr als 60% durch APC-Konzentrationen von 0,1 µM inhibiert, ebenso wie auch die Anhaftung der Linsenepithelzellen um mindestens 50% in Gegenwart von 0,1 µM APC.

Schlussfolgerung

APC hemmen die Proliferation und Anhaftung von humanen Linsenepithelzellen in-vitro. Die Substanz ist topisch applizierbar und eine intraoperative Anwendung zur pharmakologischen Nachstarprophylaxe mit APC grundsätzlich möglich.

Schlüsselwörter

NachstarHintere KapselfibroseKataraktAlkylphosphocholineLinsenepithelzellen

Alkylphosphocholines inhibit lens epithelial cell proliferation and attachment

Abstract

Background

Posterior capsule opacification (PCO) is one of the major concerns in modern cataract surgery. Ten years after successful surgery, Nd:YAG capsulotomy is required in up to 42% of patients with an acrylic sharp-edged intraocular lens (IOL). Some accommodative and multifocal IOLs display even higher capsulotomy rates. Pharmacologic prophylaxis with alkylphosphocholines (APCs) could be a novel option in PCO prevention.

Methods

The human lens epithelial cell line HLE-B3 served as an in-vitro model. After incubation with APCs in different concentrations (0.01, 0.1, and 1 mM), the trypan blue exclusion assay and the live/dead test were performed at serum concentrations of only 5%. Cell proliferation was assessed with the MTT test. Evaluation of cell attachment was done with fibronectin- and laminin-coated wells.

Results

APCs can inhibit the proliferation of human lens epithelial cells in the presence of only 5% serum in a dose-dependent manner. Proliferation inhibition of 60% and attachment inhibition of about 50% were reached at concentrations of 0.1 µM.

Conclusion

APCs inhibit proliferation and attachment of human lens epithelial cells in nontoxic concentrations in vitro. The substance can be applied topically, and an intraoperative application for pharmacologic PCO prophylaxis is feasible.

Keywords

After-cataractPosterior capsule opacificationCataract surgeryAlkylphosphocholineLens epithelial cells

Aktueller Stand der Therapie: Nachstarprophylaxe

Trotz enormer Entwicklungen und Verbesserungen hinsichtlich des Linsenmaterials, der Haptik sowie der operativen Technik ist der Nachstar die häufigste Ursache für eine erneute Visusminderung nach erfolgreicher Kataraktoperation [1, 8]. Besonders die steigende Lebenserwartung lässt Nachstarraten von 42% 10 Jahre postoperativ realistisch erscheinen [25]. Der zunehmende Einsatz akkomodativer und multifokaler Intraokularlinsen ist ebenfalls mit höheren Nachstarraten verbunden bzw. die einwandfreie Funktion dieser Linsen ist mit der Entwicklung eines Nachstars nur selten vereinbar [16, 19]. Vor dem Hintergrund von ca. 440.000 Kataraktoperationen pro Jahr allein in Deutschland stellt die Nd:YAG-Kapsulotomie neben ihren zwar selten auftretenden, aber nicht unerheblichen Komplikationen [9, 11, 18] eine bedeutende finanzielle Belastung für das Gesundheitssystem dar [2].

Pharmakologische Therapieansätze könnten zu einer eleganten Lösung dieses Problems führen [13], weshalb eine große Anzahl von Wirkstoffen bereits untersucht wurde. Klinisch etabliert hat sich jedoch keiner dieser Therapieansätze [10, 12, 21], da die Hemmung des Nachstars entweder nicht ausreichend war oder aber toxische Nebenwirkungen auftraten [20, 26]. Hauptangriffspunkt der Therapeutika sind die nach Entfernung der Linse im Kapselsack verbliebenen Linsenepithelzellen, die durch ihre Proliferation und Anhaftung zu einer Eintrübung der hinteren Linsenkapsel führen.

Alkylphosphocholine (APC) stellen eine relativ neue Klasse pharmakologisch aktiver Substanzen dar, die bisher insbesondere aufgrund ihrer guten antitumoralen sowie antiparasitären Wirkung bekannt wurden [14, 23]. In den letzten Jahren konnten jedoch auch viel versprechende Ergebnisse hinsichtlich des Aufhaltens von Anhaftung, Migration, Proliferation und Kontraktion an okulären Zellen gezeigt werden [3, 4, 5, 6, 7]. Der genaue Wirkmechanismus dieser Substanzen scheint eine Interaktion mit Membranlipiden und mit der Proteinkinase C zu beinhalten [24]. Die bisherigen In-vitro-Untersuchungen wurden alle in Gegenwart von relativ hohen Serumkonzentrationen durchgeführt (10–20% „fetal calf serum“, FCS). Um die physiologische Situation in einem Auge nach Kataraktoperation nachzustellen, haben wir die Wirksamkeit der APC in dieser Arbeit erstmals in Gegenwart von nur 5% FCS getestet.

Material und Methoden

Zellkultur

Die humane Linsenepithelzelllinie HLE-B3 wurde über ATCC, Rockville, MD, USA bezogen und auf Zellkulturflaschen und Platten in „Eagle’s modified essential medium“ (MEM) mit zunächst 20% FCS, 50 IU Penicillin/ml und 50 µg Streptomycin/ml bei 37 °C in Gegenwart von 5% CO2 kultiviert. Das Medium wurde jeden 3. Tag gewechselt. Trypsin-EDTA wurde für die Subkultivierung der Zellen nach Erreichen von Konfluenz verwendet. Da die physiologischen Gegebenheiten im Auge von deutlich geringeren Serumkonzentrationen geprägt sind, haben wir die Zellen erstmals an niedrigere Serumkonzentrationen von 5% FCS gewöhnt.

Toxizität

HLE-B3-Zellen wurden mit APC in unterschiedlicher Konzentration behandelt. Es wurden folgende Testkonzentrationen eingesetzt: 0,01 mM; 0,1 mM und 1 mM. Als Kontrolle diente PBS („phosphoate-buffered saline“). Nach 24 h wurden die Substanzen entfernt und es wurde ein Trypanblau-Ausschlusstest durchgeführt. Die Zellen wurden in einem Verhältnis von 1:1 mit Trypanblau gemischt und für 2–5 min inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension in eine Neubauer-Zählkammer überführt und meanderförmig ausgezählt. Avitale Zellen färbten sich aufgrund ihrer permeablen Zellmembran blau, während vitale Zellen ungefärbt blieben. Anschließend wurde das Verhältnis von vitalen zu avitalen Zellen errechnet. Außerdem wurde der Live/Dead-Test durchgeführt. Zellkerne avitaler Zellen färbten sich hierbei rot, da Propidiumiodid nur in tote Zellen eindringen kann. Zellkerne vitaler Zellen werden mit dem membrangängigen Farbstoff Hoechst 33342 (Intergen) blau angefärbt. Zuvor wurden die Zellen auf Vierkammerträgern ausgesät und mit den Konzentrationen 0,01; 0,1 und 1 mM über 24 h inkubiert. Das Verhältnis von vitalen zu avitalen Zellen wurde mittels Auszählen unter dem Epifluoreszenzmikroskop (Leica DMR) bestimmt.

Proliferation

Zur Untersuchung der Zellproliferation wurden die humanen Linsenepithelzellen sowohl auf mit Fibronektin als auch auf mit Laminin beschichteten 24-Well-Platten ausgesät. Diese wurden dann mit APC im nichttoxischen Konzentrationsbereich von ≤1 mM in Gegenwart von nur 5% FCS inkubiert, und es wurde eine Wachstumskurve erstellt. Anschließend konnte mittels eines Tetrazoliumreduktionsassays [MTT; (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide); Sigma-Aldrich] die Zellzahl bestimmt werden [17]. Die Zellen wurden gewaschen und mit der Lösung für 1 h bei 37°C inkubiert. Nur vitale Zellen verstoffwechseln die Lösung. Anschließend wurde die Zellmembran mittels DMSO (Dimethylsulfoxid) permeabilisiert und die optische Dichte im ELISA-Reader bei 550 nm gemessen. Die optische Dichte korreliert mit der Anzahl der proliferierenden Zellen.

Anhaftung

96-Well-Platten wurden über Nacht mit Fibronektin oder mit Laminin beschichtet. Den auf diesen Platten ausgesäten Zellen wurden APC im nichttoxischen Konzentrationsbereich von ≤1 mM und für 4 h in Gegenwart von nur 5% FCS inkubiert. Die Medien mit und ohne APC wurden anschließend entfernt und die Platten mit einem automatischen Plattenwascher gewaschen. Wiederum wurde ein Tetrazoliumreduktionsassay durchgeführt und die optische Dichte gemessen, die mit der Anzahl noch anheftender Zellen korrelierte.

Statistische Auswertung

Die Analyse der Versuchsergebnisse erfolgte mit SPSS 13.0 für Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). Für die Auswertung der Inhibitionseigenschaften der APC auf Adhäsion und Proliferation wurde der Mann-Whitney-Test angewendet. Bei allen statistischen Tests wurde p<0,05 als signifikant angesehen. Alle Versuche wurden dreimal durchgeführt.

Ergebnisse

APC hemmen die Proliferation und Anhaftung humaner Linsenepithelzellen

In den untersuchten Konzentrationen zeigte keine der Konzentrationen bis 1 mM APC eine Toxizität im Vergleich zu den Kontrollzellen in Gegenwart von nur 5% Serum (Abb. 1). Die Zellproliferation konnte schon in einem Konzentrationsbereich von nur 0,1 µM um über 60% gehemmt werden (Abb. 2). Dies ist eine um den Faktor 10.000 geringere Konzentration als die höchste noch tolerable Konzentration. Der Proliferationstest wurde sowohl mit auf Fibronektin als auch mit auf Laminin wachsenden humanen Linsenepithelzellen durchgeführt.

APC sind außerdem in der Lage, die Anhaftung humaner Linsenepithelzellen zu vermindern. Die Anhaftung der Linsenepithelzellen, die wir mit Hilfe von Fibronektin und Laminin beschichteten Platten simuliert haben, konnte zu rund 40% bei Fibronektin und zu 50% bei den mit Laminin beschichteten Platten reduziert werden. Dies ist mit Konzentrationen von 0,1 µM im Vergleich zur Kontrolle möglich (Abb. 3). Außerdem stellten wir eine verminderte Anhaftung der Zellen bei mit Laminin beschichteten Platten im Vergleich zu mit Fibronektin beschichteten Platten fest.

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Abb. 1

Ergebnisse des Live/Dead-Tests. Humane Linsenepithelzellen wurden auf Vierkammerträgern ausgesät und mit den Alkylphosphocholinkonzentrationen 0,01; 0,1 und 1 mM über 24 h bei 37 °C unter Standardzellkulturbedinungen inkubiert. Der Anteil der avitalen Zellen (rote Färbung durch Propidiumiodid) an der Gesamtzellzahl (blau; Hoechst) wurde durch Auszählen unter dem Epifluoreszenzmikroskop (Leica DMR) bestimmt

https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1007%2Fs00347-010-2128-5/MediaObjects/347_2010_2128_Fig2_HTML.gif
Abb. 2

Prozentualer Anteil proliferierender HLE-B3-Zellen in Gegenwart von 5% FCS in Abhängigkeit der Alkylphosphocholinkonzentration (APC) in µM (1: Kontrolle; 2: 0,01; 3: 0,1; 4: 1)

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Abb. 3

Prozentualer Anteil anhaftender HLE-B3-Zellen auf mit Fibronektin oder mit Laminin beschichteten Zellkulturplatten in Abhängigkeit der Alkylphosphocholinkonzentration (APC) in µM (1: Kontrolle; 2: 0,01; 3: 0,1; 4: 1)

APC als pharmakologische Nachstarprophylaxe?

In unseren In-vitro-Untersuchungen fanden wir erste vielversprechende Hinweise bezüglich des Nutzens von APC für die pharmakologische Nachstarprophylaxe. Erstmals konnten wir zeigen, dass auch in Gegenwart von nur 5% Serum eine effektive Inhibition der Zellproliferation und Anhaftung humaner Linsenepithelzellen in der Zellkultur möglich ist. Dies spiegelt die physiologischen Bedingungen im Auge besser wider als höhere Serumkonzentrationen von 20%. Außerdem konnten wir zeigen, dass APC ihre antiproliferative und antiadhäsive Wirkung auch auf Zellen, die auf mit Fibronektin oder mit Laminin beschichteten Platten wachsen, ausüben. Die Inhibition der Zellanhaftung durch APC ist ebenfalls in Gegenwart von nur 5% Serum gewährleistet, ohne dabei zytotoxisch auf die Linsenepithelzellen zu wirken. Die hier getesteten Konzentrationen erscheinen bis 1 mM APC als nicht zytotoxisch (Abb. 1).

Damit erfüllen APC eine wesentliche Voraussetzung für einen zukünftigen klinischen Einsatz als Alternative zu den bereits vorhanden Wirkstoffen für die pharmakologische Nachstarprophylaxe: Sie können wichtige pathophysiologische Schlüsselvorgänge der Nachstarentstehung, die Zellproliferation und Anhaftung in nichttoxischen Konzentrationen in Gegenwart von niedrigen Serumkonzentrationen hemmen. Insbesondere die gute Tolerabilität, die auch nach intraokularer Applikation der Substanzen in Untersuchungen am hinteren Augenabschnitt bereits gezeigt werden konnte, ist hervorzuheben [6, 22]. Diese Ergebnisse sind bei kurzzeitiger Inkubation der Zellen mit APC zu erreichen, die dem Zellkulturmedium einfach und einmalig zugegeben wurden, so wie man dies ggf. auch zukünftig bei einer intraoperativen Anwendung, z.B. der Kapselsackspülung [15], durchführen könnte. Unsere hier dargelegten Ergebnisse ermutigen uns in der Annahme, dass APC eine wichtige Rolle in der pharmakologischen Nachstarprophylaxe einnehmen könnten. Inwiefern unsere Ergebnisse zukünftig klinische Relevanz erreichen, muss in weiteren Studien geklärt werden.

Fazit für die Praxis

Die pharmakologische Nachstarprophylaxe gewinnt in der aktuellen Situation, bedingt durch die steigende Lebenserwartung der kataraktoperierten Patienten, zunehmend an Bedeutung. Der Anspruch, optisch anspruchsvolle, in der Zukunft vielleicht sogar individuell gefertigte Intraokularlinsen einzusetzen, ist mit dem Wunsch eines gleichzeitig noch zur Nachstarprophylaxe optimierten Designs kaum in Einklang zu bringen. Der Einsatz pharmakologischer Zusatzstoffe während der Operation, die einen Nachstar gar nicht erst entstehen lassen, ist, nicht zuletzt auch aus Gründen der Kosteneffektivität, verlockend. Daher wäre es wünschenswert, geeignete Pharmaka zu identifizieren und auf ihre Eignung hin zu untersuchen. Alkylphosphocholine erfüllen viele wichtige Voraussetzungen, die für einen zukünftigen klinischen Einsatz erforderlich sind und sollten daher in weiteren In-vitro- und In-vivo-Studien evaluiert werden.

Interessenkonflikt

Der korrespondierende Autor gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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