Der Pathologe

, Volume 34, Issue 1, pp 16–24

Molekularpathologie der Lunge

Perspektiven durch neue Sequenzierformen

Authors

  • C. Vollbrecht
    • Institut für PathologieUniversitätsklinik zu Köln
  • K. König
    • Institut für PathologieUniversitätsklinik zu Köln
  • L. Heukamp
    • Institut für PathologieUniversitätsklinik zu Köln
  • R. Büttner
    • Institut für PathologieUniversitätsklinik zu Köln
    • Institut für PathologieUniversitätsklinik zu Köln
Schwerpunkt

DOI: 10.1007/s00292-012-1704-7

Cite this article as:
Vollbrecht, C., König, K., Heukamp, L. et al. Pathologe (2013) 34: 16. doi:10.1007/s00292-012-1704-7

Zusammenfassung

Lungenkarzinome gehören zu den häufigsten bösartigen Tumorerkrankungen der westlichen Welt. Sie sind mit einem weiten Spektrum von Mutationen assoziiert, die vor allem Gene therapierelevanter Signalwege betreffen. Aufgrund der wachsenden Zahl an genetischen Loci, die für eine verbesserte Einordnung der Lungenkarzinome untersucht werden müssen, sind neue, hocheffiziente Ansätze einer weiter reichenden Mutationsanalyse gefragt. Umfangreiche Mutationsanalysen progressions- und therapierelevanter Gene können durch die neuen Sequenzierformen sog. „Next-generation-sequencing“ (NGS)-Ansätze angegangen werden, da diese aufgrund besonders hoher Sequenzierkapazitäten die Möglichkeit bieten, eine Vielzahl von Genen hochauflösend zu untersuchen.

Für molekularpathologische Untersuchungen stehen zurzeit im Wesentlichen drei Plattformen zur Verfügung, die die parallele Sequenzierung von multiplen Genen und Proben in einem Sequenziergang ermöglichen: die 454- oder Pyrosequenzierung, die synthesebasierte Sequenzierung und die Halbleitersequenzierung, in der die Protonenabgabe beim Nukelotideinbau gemessen wird. Das Prinzip, dass nach klonaler Expansion einzelner DNA-Moleküle sequenziert wird, erlaubt nicht nur Angaben zur Allelfrequenz und zur Mutationsrate, sondern bietet auch sehr hohe Empfindlichkeiten in der Detektion von niedrigfrequenten Varianten.

Schlüsselwörter

ParallelsequenzierungPyrosequenzierungHalbleitersequenzierungMultiplexanalysePersonalisierte Onkologie

Molecular pathology of the lungs

New perspectives by next generation sequencing

Abstract

Lung cancer is one of the most frequent malignancies in the western world. Its frequent association with a wide spectrum of mutations in genes encoding various signal transducers that are often linked to therapy response, emphasizes the obvious need for improved, fast and highly efficient approaches in molecular pathology. Comprehensive analyses of the mutation status of progression and therapy relevant genes can be performed by the novel sequencing forms named next generation sequencing (NGS) providing extremely high capacities for ultra-deep sequence analyses.

The 454 pyrosequencing method, the sequencing by synthesis and the semiconductor sequencing platform are now available for parallel sequencing approaches of multitudinous target genes linked to multiple tumor DNA applications. The “one molecule, one clone, one read” principle by the NGS approaches supplies not only information on allele frequencies and mutation rates but also has the advantage of a very sensitive detection of low frequency variants.

Keywords

Parallel sequencingPyrosequencingSemiconductor sequencingCancer panelPersonalized oncology

Das Lungenkarzinom ist die häufigste krebsbezogene Todesursache des 20. Jahrhunderts [1]. In Deutschland sterben fast 50.000 Menschen jährlich an den Folgen des Lungenkarzinoms, wobei die Inzidenz beim Mann fast 4-mal so hoch ist wie bei der Frau [1]. Die 5-Jahres-Überlebensrate der Patienten mit Lungenkarzinom in der westlichen Welt liegt nur bei etwa 15% [1]. Neue Therapieansätze, die individuell an die histologischen und molekularen Subtypmerkmale angepasst werden können, sind daher dringend erforderlich. Die molekularpathologische Diagnostik steht so vor der neuen Herausforderung, eine detaillierte molekulare Charakterisierung der Lungenkarzinome für eine zielgerichtete Therapie zur Verfügung zu stellen.

Somatische genetische Veränderungen im Lungenkarzinom

Im Fokus der Entwicklung neuer Therapieformen des Lungenkarzinoms stehen zielgerichtete Ansätze, die tumorrelevante zentrale Signalwege repressiv beeinflussen. Die „Epidermal-growth-factor-receptor“ (EGFR)-Familie spielt eine dominante Rolle in der Karzinogenese, da die EGFR als membranständige Tyrosinkinaserezeptoren Signaltransduktionswege von Zellproliferation, Apoptose, Zellmotilität und Neovaskularisierung einleiten [7].

Gegenüber dem kleinzelligen Lungenkarzinom („small cell lung cancer“, SCLC) macht das nichtkleinzellige Lungenkarzinom („non-small cell lung cancer“, NSCLC), zu dem histopathologisch die Varianten des Plattenepithelkarzinoms, das Adenokarzinom mit verschiedenen Subtypen und das großzellige Lungenkarzinom („large cell lung cancer“, LCLC) gehören, mehr als 80% aller Lungenkarzinome aus. Der EGFR ist in 40–70% der NSCLC überexprimiert [18]. Daher sind die Mitglieder der EGFR-Familie gesuchte Zieldomänen neuer Therapieformen, die EGFR-blockierende Antikörper, wie z. B. Cetuximab, Panitumumab, oder signalinhibierende Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI), wie z. B. Gefitinib, Erlotinib, einsetzen [7]. Neben EGFR-Genamplifikationen kommen Mutationen im EGFR-Gen zwischen 10 und 15% im Lungenkarzinom vor und betreffen vorwiegend Adenokarzinome [16]. Diese Mutationen liegen in der tyrosinkinasekodierenden Domäne der Exone 18–21. Eine Metaanalyse von Yamamoto et al. fasste 569 Mutationen bei nahezu 3000 untersuchten Lungenkarzinomen zusammen, die sich vor allem auf das Exon 19 (48%) und Exon 21 (43%) verteilten. Die häufigsten Mutationen wie die Deletionen im Exon 19 oder die L858R-Punktmutation im Exon 21, aber auch die im Kodon 719 (Exon 18) beeinflussen die EGFR-blockierende TKI-Therapie positiv [19]. Die Mutation T790M im Exon 20 vermittelt dagegen eine primäre Therapieresistenz [21].

In Plattenepithelkarzinomen der Lunge (etwa 5%) kommt es auch zu Deletionen der Exone 2–7, die dann Resistenz für die Therapie mit Gefitinib und Erlotinib, nicht aber für Neratinib vermitteln [8].

Die EGFR-Therapie hängt aber ebenfalls vom Mutationsstatus der EGFR-eingeleiteten Signalwege ab wie dem RAS/RAF/MAPK- und dem PIK3CA/AKT/MTOR-Weg [7]. Die Punktmutationen im Kodon 12, 13 des KRAS-Gens und ebenfalls – wenn auch seltener im Kodon 61 – führen zur konstitutiven Aktivierung und damit zur Therapieresistenz [5]. KRAS-Mutationen kommen in 32% der Adenokarzinome vor [5], während BRAF-Mutationen mit einer Häufigkeit von 3% vertreten sind [14]. Die Mutationen des BRAF betreffen v. a. die Aminosäureaustausche V600E/K (50%), D594G (11%) und G469A (39%, [14]). Neben dem RAS/RAF/MAPK-Weg kann der Mutationsstatus der Signaltransduktoren des PIK3CA/AKT/MTOR-Weges ebenfalls den Therapieerfolg beeinflussen. Hier sind v. a. die Mutationen im Exon 9 (E542K, E542K/Q) und im Exon 20 (H1047R/L) der PIK3CA-Untereinheit zu nennen. Die wesentlichen Treibermutationen des Lungenadenokarzinoms sind in Abb. 1 zusammengefasst.

https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1007%2Fs00292-012-1704-7/MediaObjects/292_2012_1704_Fig1_HTML.gif
Abb. 1

Wesentliche Treibermutationen beim Lungenadenokarzinom. (Mod. nach [2])

Daneben kommt es zu zahlreichen anderen genetischen Veränderungen, die Therapiemöglichkeit und -erfolg maßgeblich beeinflussen. Das ALK („anaplastic lymphoma kinase“)-Gen kodiert für eine Tyrosinkinase. Eine Inversion des Exon 19 im ALK-Gen führt durch die resultierende Fusion mit EML4 („echinoderm microtubule associated protein-like 4“) zur konstitutiven ALK-Aktivierung [6]. Andere EML4-ALK-Fusionsprozesse sind ebenfalls für die Therapie mit Crizotinib von hoher Bedeutung. Die Amplifikation des Gens des proliferationsinduzierenden Met-Rezeptors im Adenokarzinom (2%) und des FGFR1 im Plattenepithelkarzinom (etwa 1%) sind ebenfalls wichtige genetische Hinweise für die zukünftige Therapiefindung.

Die Zahl der identifizierten genetischen Veränderungen, die die therapeutischen Herangehensweisen verbessert und eine individuelle Behandlung der Patienten erlaubt, wächst ständig. Einen Einblick in den aktuellen Stand relevanter Gene für Diagnostik und Therapie bietet Tab. 1.

Tab. 1

Tumor- und therapierelevante genetische Veränderungen im Lungenkarzinom

Gene

Tumor- oder therapierelevante Veränderungen

Lungenkarzinom

Präparat/Wirkstoff (Firma)

Literatur

Akt

Aktivierende Mutationen: z. B. Exon 4 (E17K)

SCC (NSCLC)

Mk2206 (Merck)

[29]

ALK

Primär therapiesensitive Mutationen: z. B.

Exon 23 (F1174),

Exon 25 (R1275)

Resistenzmutationen: z. B.

Exon 23 (L1196M, L1198P, D1203N)

NSCLC

Crizotinib (Pfizer),

TAE-684,

GSK1838705A (Glaxo Smith Kline),

ASP26113 (Ariad),

LDK375 (Novartis)

[22, 35]

Überexpression/Amplifikation

BRAF

Aktivierende Mutationen:

Exon 11 (G466V, G469A, Y472C)

v. a. Exon 15 (V600E)

LAC

(NSCLC)

GSK2118436 (Glaxo Smith Kline)

[24, 28, 31]

BRCA1

Geringe Expression

NSCLC

Keine Angabe

[27, 34]

DDR2

Aktivierende Mutationen:

u. a. Exon 8 (S768R)

SCC (NSCLC)

Dasatinib (Bristol Meyers Squibb)

[29, 35]

EGFR

Aktivierende Mutationen: v. a.

Exon 18 (G719X),

Exon 19 (746- bis 751-Deletion),

Exon 20 (V765A, T783A),

Exon 21 (L858R, L861Q)

Resistenzmutationen: v. a.

Exon 19 (D761Y),

Exon 20 (S768I, T790M)

LAC (NSCLC)

Gefitinib (AstraZeneca),

Erlotinib (Roche),

Icotinib (Zhejiang Beta Pharma),

Afatinib (Boehringer Ingelheim), Dacomitinib (Pfizer),

Neratinib (Pfizer),

AP26113 (Ariad),

Lapatinib (Glaxo Smith Kline),

Cetuximab (Bristol Meyers Squibb)

[23, 27, 29, 33, 34, 35]

Amplifikation/Überexpression

SCC (NSCLC)

EML4-ALK

Genfusion z. B.

(EML4-Exon 13 mit ALK-Exon 20)

LAC (NSCLC)

Crizotinib (Pfizer),

NMS-E628 (Nerviano Medical Sciences)

[22, 27, 34, 35]

EphA2

Aktivierende Mutationen:

Exon 5 (G391R)

SCC (NSCLC)

Dasatinib (Bristol Meyers Squibb),

MEDI547 (medimmune)

[29]

ERCC1

Geringe Expression

NSCLC

Paclitaxel (Bristol Meyers Squibb)

[27, 28, 34]

FGFR1

Amplifikation

SCC (NSCLC)

Brivanib (Bristol Meyers Squibb),

BIBF1120 (Boehringer Ingelheim),

BGJ398 (Novartis),

E-3810 (EOS),

Azd4547 (AstraZeneca)

[25, 29, 35]

IGF1R

Überexpression

SCC (NSCLC)

R1507 (Roche),

MK0646 (Merck),

AVE1642 (Sanofi-Aventis), Figutumumab (Pfizer)

[22, 29, 34]

KRAS

Konstitutiv aktivierende Mutationen:

(vermitteln EGFR-Therapieresistenz)

Exon 2 (G12X, G13X),

Exon 3 (Q61X)

LAC (NSCLC)

Siehe EGFR

[23, 24, 27, 29, 33]

MDM2

Amplifikation

SCC (NSCLC)

Nutlin (Sigma-Aldrich)

[9]

MET

Amplifikation

a

MetMab (Gentech),

INC280 (Novartis),

Tivantinib (Daiichi-Sankyo),

Crizotinib (Pfizer)

[29, 32, 34]

PDGFRA

Amplifikation

SCC (NSCLC)

Pazopanib (Glaxo Smith Kline), AG-013736 (Pfizer),

MEDI575 (AstraZeneca)

[29]

PIK3CA

Therapieresistente: v. a.

Exon 9 (E542K, E542K/Q),

Exon 20 (H1047R/L)

SCC (NSCLC)

BKM120 (Novartis),

GDC0941 (Roche),

XL147(Sanofi-Aventis)

[29, 30, 36, 37]

Amplifikation

PTEN

Verlust

NSCLCa

Keine Angabe

[26, 29, 34]

Inaktivierende Mutation:

Exon 7 (R233)

SCC (NSCLC)

SOX2

Amplifikation

SCC (NSCLC), SCLC

Keine Angabe

[29]

TP53

„Loss-of-function“-Mutation

a

Keine Angabe

[27, 29]

ALK „anaplastic lymphoma kinase“; EGFR „epidermal growth factor receptor”; EML4 „echinoderm microtubule associated protein-like 4“; LAC „lung adenocarcinoma“; SCC „squamous cell lung cancer“; NSCLC non-small cell lung cancer; akeine Assoziation mit spezifischer Histologie.

Infobox 1 Zusatzmaterial online

Dieser Beitrag enthält eine zusätzliche Tabelle. Dieses Supplemental finden Sie unter dx.doi.org/10.1007/s0092-012-704-7.

Parallele Sequenzierung

„Next generation sequencing“

Die hohe molekulargenetische Variabilität von Tumoren, die die Progression und die Therapie weitgehend beeinflussen, macht eine immer umfangreichere molekularpathologische Diagnostik nötig. Durch die hohe Kapazität von mehr als 100 Mb (Megabasen) bis 200 Gb (Gigabasen) bieten die neuen Sequenzierformen, die als „next generation sequencing“ (NGS) bezeichnet werden, einen sehr effizienten und zeitsparenden Ansatz, eine Vielzahl von tumor- und therapierelevanten Zielabschnitten parallel im Multiplexverfahren zu analysieren. Der Vorteil des NGS-Ansatzes, eine immens hohe Sequenzierkapazität (Tab. 2) zu bieten, wird durch die Möglichkeit ergänzt, im Gegensatz zu den traditionellen Sequenzierungsverfahren einzelne Moleküle nach klonaler Amplifikation zu sequenzieren. Dadurch kann der Mutationsstatus quantitativ erfasst und können vor allem mutierte Allele vor einem hohen Hintergrund sensitiv detektiert werden (Abb. 1).

Das NGS-Prinzip: ein Molekül – ein Klon – eine Sequenzanalyse ist in Abb. 2 dargestellt. In der konventionellen Sequenzierform werden Zielabschnitte einer DNA-Population in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und anschließend durch das Sanger-Terminations- oder das Pyrosequenzierverfahren sequenziert. Jedes Signal repräsentiert daher die gesamte Population. Bei Tumoren mit einem hohen Anteil an Nichttumorzellen, wie Entzündungs- oder Stromazellen, kann dann die Detektion von Mutationen durch den hohen Hintergrund an Wildtypallelen schwierig sein. Gegenüber der konventionellen Sequenzierform werden durch NGS einzelne Moleküle analysiert. Hierzu werden die Zielabschnitte einer DNA-Population mit Adaptern versehen, durch die einzelne Moleküle mittels komplementär ausgerichteter Sondenstränge eingefangen werden. Die Sonden können zur Vereinzelung an „beads“ oder einen Träger gebunden sein. Nach Vereinzelung werden die Zielabschnitte klonal an den „beads“ durch eine Emulsions- bzw. am Träger durch Brücken-PCR amplifiziert. Die Klone, die jeweils ein Molekül des Ziel-DNA-Abschnitts repräsentieren, werden anschließend parallel sequenziert. Die neuen Sequenzierformen sind daher durch das Prinzip ein Molekül – ein Klon – eine Sequenzanalyse gekennzeichnet.

Tab. 2

Plattformen neuer Sequenzierformen

Illumina

454/Roche

Ion Torrent (ABIb)

Solid (ABIb)

Helicos Heliscope

Pacific Biosciences

Prinzip

Reversible synthesebasierte Terminatorsequenzierung

454/Pyrosequenzierung

„Semiconductor“-Sequenzierung

Sequenzielle Dinukleotidligation

Einzelmolekülsequenzierung

Einzelmolekülsequenzierung

Signaldetektion

4-Farbenfluoreszenz

Lumineszenz

pH-Messung

4-Farbenfluoreszenz

4-Farbenfluoreszenz

4-Farbenfluoreszenz

Maximale Kapazität

HiSeq 2000: 600 Gb

GS FlX: 700 Mb

Proton: 10 Gb

350 Gb

k. A.

k. A.

MiSeq: 2–8 Gba

GS Junior: 35–50 Mb

PGM: 1 Gb

Laufzeit

HiSeq 2000: 11–14 d

GS FlX: 24 h

Proton: 5 h

k. A.

k. A.

MiSeq: 18–39 ha

GS Junior: 8 h

PGM: 2–5 h

7 d

8 d

1 d

Matrizenpräparation

Brücken-PCR

Emulsions-PCR

Emulsions-PCR

Emulsions-PCR

Entfällt

Entfällt

Leselängen

75–200 b

600–800 b

100–400 b

75 b

35 b

6 Kb

Kosten pro bp

Gering

Hoch

Gering

k. A.

k. A.

Vorteil

Eignung für hohen Sequnezierungsdurchsatz

Erfahrung des Herstellers

Hohe Flexibilität im Sequenzierungsdurchsatz durch unterschiedliche 314er bis 318er Chips

Sehr wenig Lesefehler, interne Fehlerkorrektur

Einzelmolekülsequenzierung

Einzelmolekülsequenzierung

Sehr geringe Laufkosten bei hohem Durchsatz

Lange Leseweiten

Geringe Laufkosten

Lange Leselängen

Schnell

Sehr schnell

Schnell

Nachteil

Auftreten von GGC Motiv-Lesefehlern; falsch negative

Auftreten von Homopolymer-Lesefehlern; falsch positive

Hohes Auftreten von Homopolymer-Lesefehlern; falsch positive

lange Laufzeit, aufwendige Chemie

Hohes Auftreten von Lesefehlern, lange Laufzeit

Hohes Auftreten von Lesefehlern

Fett und kursiv gedruckt: Plattformen mit Eignung für die Diagnostik aufgrund von Kosten, Durchsatz und Kapazität; b Basen; bp Basenpaare; aabhängig von der Leselänge; ABIb Life Technologies; k. A. keine Angabe.

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Abb. 2

Prinzip der parallelen Sequenzierung von Einzelmolekülen nach klonaler Amplifikation im „Next-generation-sequencing“ (NGS)-Ansatz im Vergleich zum „1st generation sequencing“. (Erläuterungen s. Text)

Technische Ansätze der neuen Sequenzierformen

Die parallele Analyse einer Vielzahl einzelner DNA-Moleküle bis hin zum gesamten humanen Genom kann durch unterschiedliche Ansätze erreicht werden. Das Prozedere gliedert sich im Wesentlichen in
  1. a)

    Herstellung der zu sequenzierenden DNA-Bibliothek durch Auswahl der DNA-Abschnitte und Anbringen der Adapter,

     
  2. b)

    Vereinzelung der adapterkonjugierten DNA-Moleküle und klonale Amplifikation,

     
  3. c)

    Sequenzierung und

     
  4. d)

    Datenanalyse.

     

Die Sequenzierung wird auf drei wesentlichen Plattformen für diagnostische Zwecke durchgeführt:

Die Pyrosequenzierung wurde 2005 erstmalig als Sequenziertechnik von Jonathan Rothberg (CuraGen Corporation, Branford, CT/USA) zur parallelen Sequenzierung eingesetzt und als 454-Sequenzierung bezeichnet [11]. Die Firma Roche hat die Plattform übernommen und sowohl im „Genome Sequencer FLX Titanium System“ weiterentwickelt als auch später im Laborbankgerät „Benchtop GS Junior System“ erstmals für Forschungs- und diagnostische Labore angepasst. In diesem Verfahren werden einzelne DNA-Moleküle mit Sonden anhand der Adaptersequenz aus der mit Adaptern versehenen DNA-Population herausgefischt. Da die Sonden an Trägerkügelchen („beads“) gebunden sind, können einzelne DNA-Moleküle nun bearbeitet werden. Die einzelnen immobilisierten DNA-Moleküle werden anschließend durch eine Emulsions-PCR klonal amplifiziert und dann als Klone durch die Pyrosequenziertechnik in einer Picotiterplatte sequenziert (Abb. 3).

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Abb. 3

Die 454-Parallelsequenzierung – der erste „Next-generation-sequencing“ (NGS)-Ansatz. Einzelne Moleküle aus der mit Adaptern versehenen DNA-Population werden mit adaptersequenzkomplementären Sonden herausgefischt und so vereinzelt an „beads“ gebunden. Die „bead”-gebundenen Moleküle werden durch eine Emulsions-PCR, in der jede wässerige Tropfeneinheit einen PCR-Mikroreaktor bildet, klonal amplifiziert. Die an „beads“ gebundenen Klone werden in eine Picotiterplatte, in der jedes „bead“ in einen Einsatz passt, transferiert und hier durch Pyrosequenzierung einzelnen parallel sequenziert. (Modifiziert nach Roche)

Die Grundlagen des Arbeitsganges wurden später von Jonathan Rothberg erneut aufgenommen. Allerdings wird im neuen Verfahren nicht mehr das Pyrophosphat, das beim Einbau eines Nukleotids bei der Sequenzierungsreaktion freigesetzt wird, als Sequenziersignal genutzt, sondern das ebenfalls freiwerdende Proton. So kann der klonale Einbau der Nukleotide durch eine pH-Messung in einer mikrodimensionierten Halbleiterpicotiterplatte sehr empfindlich erfasst werden [17]. Diese Entwicklung von Jonathan Rothberg im Rahmen der Firma Ion Torrent wurde durch die Produktion des PGM („Personal Genome Machine“) und des „Proton-Ion-Torrent“-Gerätes durch die Firma Life Technologies übernommen und kommerziell für den Forschungs- und diagnostischen Laborbedarf angeboten. Das Verfahren hat gegenüber der Pyrosequenzierung den Vorteil, dass das Signal direkt gemessen wird und nicht wie bei der Pyrophosphatdetektion über enzymatische Reaktionen in ein Lichtsignal umgewandelt werden muss (Abb. 3). Daher ist die Methode wesentlich kostengünstiger als beim früheren Pyrosequenzierverfahren.

In den Genome Analyzer Systemen der Firma Illumina (HiSeq 2000, MiSeq) hingegen wird die Sequenzierung ähnlich wie bei der konventionellen Sanger-Sequenzierung durch fluorochrommarkierte Nukleotide durchgeführt. Die klonale Amplifikation der einzelnen Moleküle, die durch Adaptersonden auf einem Träger vereinzelt werden, wird durch eine clusterartige, sog. Brücken-PCR erreicht. Durch die Entwicklung des „MiSeq“-Gerätes der Firma Illumina steht auch hier ein kleines System ähnlich dem „GS-Junior“-System der Firma Roche oder dem „PGM Ion Torrent“ der Firma Life Technologies zur Verfügung, dessen Kapazität für Gesamtgenomanalysen nicht ausreicht, aber gerade für die zielgenfokussierte Anwendung diagnostischer Labore in puncto Kapazität, Kosten und Durchsatz besonders gut geeignet ist. Der zielgenfokussierte Umgang im Sequenzierungsverfahren, der bei geringerem Durchsatz kostengünstiger ist, wird nicht für die „Solid“-Technologie der Firma Life Technologies verfolgt, deren Sequenzierverfahren durch Ligation von fluorochrommarkierten Oligonukleotiden gekennzeichnet ist. Ebenfalls sind die Techniken zur Einzelmolekülanalyse ohne klonale Amplifkationen der Firma Helicos Heliscope und von Pacific Biosciences nur für weitreichende Analysen – wie Gesamtgenomanalysen – auf dem Markt, nicht aber für den diagnostisch fokussierten Umgang.

Vor- und Nachteile verschiedener Sequenzierformen

Die drei Systeme „GS Junior“ (Roche), „PGM Ion Torrent“ (Life Technologies) und „MiSeq“ (Illumina), die in jüngster Vergangenheit aufgrund von Kosten und Durchsatzmöglichkeiten in diagnostischen Laboren immer häufiger Anwendung finden, haben Vor- und Nachteile in der Sequenzierkapazität, in der Sequenzierfragmentlänge und in der Sequenzierdauer (Tab. 2). Trotz einer hohen Sequenziergenauigkeit aller Systeme werden ebenfalls systemspezifische Unterschiede beschrieben. Nakamura et al. [12] zeigten Schwierigkeiten in den Illumina-Systemen auf, GGC-Motive fehlerfrei zu lesen. In einem direkten Vergleich der Systeme wurden aber bei der Illumina-Plattform nur fehlerhafte Sequenzen beobachtet, wenn dem GGC-Motiv keine AT-reichen Regionen folgten [15]. In der protonenbasierten Sequenzanalyse durch das „Ion-Torrent“-System der Firma Life Technologies konnten AT-reiche Domänen nur mit schlechten Ausbeuten in der Sequenzierungsabdeckung („coverage“) sequenziert werden. Im Vergleich kommt es zu etwas geringeren Fehlerhäufigkeiten auf dem Illumina- (0,4%) als auf dem „Ion-Torrent“-System (1,78%) [9, 15]. Eine höhere Fehlerrate bei der protonenbasierten Sequenzierung, aber auch bei der Pyrosequenzierung, wird vor allem durch die Schwierigkeit, die Signalstärken beim Nukleotideinbau in Regionen mit mehr als 8 Basenwiederholungen (Homopolymere) zu differenzieren [15]. Dagegen werden aber Einzelnukleotidvarianten vom Illumina-System (68–76%) gegenüber dem „Ion-Torrent“-System (82%) geringfügig schlechter erkannt ([15]; Tab. 2). Die verschiedenen Plattformen werden jedoch zurzeit hinsichtlich Genauigkeit, Kapazität und Sequenzlängen ständig weiterentwickelt und verbessert.

Einsatz der neuen Sequenzierformen in der Molekularpathologie

Aufgrund der stetig wachsenden Zahl prognoserelevanter genetischer Veränderungen hat der Einzug der neuen Sequenzierformen in die molekularpathologischen Labore begonnen [3]. Gegenüber der konventionellen Sanger-Sequenzierung hat die Parallelsequenzierung den Vorteil der quantitativen Mutationserfassung und der möglichen Erfassung von nur wenig mutierten Allelen bei sonst hohem Wildtypanteil. Das kann besonders wichtig bei Nachweisen in Tumoren mit einem hohen Entzündungs- oder Stromaanteil sein. Die hohe Sensitivität der NGS-Nachweise ermöglicht ebenfalls Untersuchungen an zirkulierenden Tumorzellen oder an zirkulierender DNA [10, 13].

Zudem können durch die NGS eine Vielzahl von Genen und Genloci bei mehreren Patienten analysiert werden. Für onkologische Fragestellungen werden mögliche Zielloci zurzeit in „cancer panels“ zusammengeschlossen [20]. Die Zielgene, die eine detaillierte onkogenetische Analyse der Lungenkarzinome ermöglichen („lung cancer panel“), sind in Tab. 1 aufgelistet.

Die Selektion der zu bearbeitenden Zielloci aus der Tumor-DNA-Population erfolgt dabei vor allem durch zielgenspezifische Primer und anschließende PCR der Sequenzierzieldomänen (Abb. 4). In einem anderen Verfahren basiert die Auswahl auf Sonden, die zum Zielstrang komplementär sind und so durch Hybridisierung die Matrizen-DNA einfangen [4]. Ein solches „Capture“-Verfahren (Abb. 4) kann aber auch mit Antikörpern statt mit Sonden durchgeführt werden. So können z. B. mit Anti-Methyl-Antikörper methylierte und hydroxymethylierte DNA eingefangen und in das Verfahren eingesetzt werden [3]. Die Auswertung kann durch „Open-source“-Möglichkeiten wie z. B. den Integrative Genome Viewer oder durch kommerzielle Software wie u. a. SeqNext (JSI Medical Systems, GER), NextGENe (SoftGenetics, USA), Avadis (Strand Scientific Intelligence, USA) oder SeqManNGene (DNAStar, USA) erfolgen. Die Vorteile der NGS gegenüber der Sanger-Sequenzierung sind in Tab. 3 zusammengefasst.

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Abb. 4

Ablauf und methodische Bausteine der neuen Sequenzierformen in der Molekularpatholgie. Der „Next-generation-sequencing“ (NGS)-Ablauf wird in die Herstellung einer adapterkonjugierten DNA-Bibliothek („library“), die klonale Amplifikation, die parallele Sequenzierung der Klone und die Datenauswertung unterteilt. Die Bibliothek wird in der Molekularpathologie aufgrund der geringen DNA-Einsatzmenge beim Einsatz von DNA aus formalinfixierten Tumoren meist durch Amplikons (Amplikonbibliothek) hergestellt. Hier können die Adaptersequenzen durch den Primer oder durch anschließende Ligation eingeführt werden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) für ein „panel“ an Zielgenen kann in Einzelansätzen oder im Multiplexverfahren erfolgen. Nach klonaler Amplifikation der adapterkonjugierten DNA-Einzelmolküle durch Brücken- oder Emulsions-PCR erfolgt die plattformspezifische Sequenzierung. (ABI*: Life Technologies).

Tab. 3

Vergleich der Sanger-Sequenzierung mit „next generation sequencing“ (NGS)

Sanger

NGS

Anmerkung

Kosten pro Base

Hoch

Gering

Möglichkeiten der effizienten Multiplex-Analyse

Nein

Ja

Simultane Analyse von mehreren 100 Loci einer Vielzahl von Patientenproben

Notwendiges Erfahrungspotenzial

Vorhanden

Fehlt

Auswertungserfahrung

Vorhanden

Fehlt

Für NGS

Geräteanschaffungskosten

Hoch

Gesamtzeitaufwand für Arbeitsgang

Gering

Sehr hoch

Aufwand ist bei NGS aufgrund von zahlreichen Fragmentaufreinigungen sehr hoch, erfordert ggf. Automatisierung

Zeitaufwand pro Genloci-Analyse

Hoch

Gering

Lesegenauigkeit

Sehr gut

Sehr gut

Sensitivität der Detektion von Varianten

Gut

Sehr gut

Möglichkeiten der Detektion von „Gene-copy-number“-Translokation

Nein

Ja

Eingeschränkt

Ja

Für den Einsatz der neuen Technologien müssen die geringen Ausbeuten und die Qualitätseinbußen der DNA-Extrakte aus formalinfixiertem und paraffineingebettetem (FFPE)-Material berücksichtigt werden. Daher wird in molekularpathologischen Ansätzen die Selektion durch zielgenspezifische PCR-Assays mit geringen Einsatzmengen (10–50 ng) zurzeit favorisiert. Die Adaptersequenzen zur Vereinzelung der Moleküle und späteren Sequenzierung der Klone können hier durch die Primersequenzen eingeführt werden (Abb. 5a) oder durch die anschließende Ligation an die PCR-Produkte. Tragen die Adaptersequenzen zusätzlich patientenspezifische Identifizierungssequenzen (MID), ist es möglich, die PCR-Ansätze von mehreren Patientenproben zu mischen. Es können sowohl eine Vielzahl von PCR-Einzelansätzen zusammengeführt und gleichzeitig behandelt werden (Abb. 4, Abb. 5, Abb. 6a) als auch ein Multiplex-PCR-Ansatz bearbeitet werden. Die verschiedenen Möglichkeiten der Herstellung der Adapter-DNA-Bibliothek zeigt Abb. 4. Das anschließend gewählte Sequenzierverfahren (Tab. 2) ist unabhängig vom Herstellungsmodus der Adapter-DNA-Bibliothek. Ebenfalls kann zur Auswertung der Sequenzen verschiedene Software eingesetzt werden (Abb. 5, Abb. 6).

https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1007%2Fs00292-012-1704-7/MediaObjects/292_2012_1704_Fig5_HTML.gif
Abb. 5

EGFR („epidermal growth factor receptor“)-Genanalyse durch parallele 454-Sequenzierung. a DNA von NSCLC („non-small cell lung cancer“) wurde mit EGFR-spezifischen Primern für Exon 18,19, 20, und 21 (Roche) amplifiziert. Im Rahmen der PCR wurden sowohl patientenspezifische Identifizierungssequenzen (MID) als auch die „Forward“- und „Reverse“-Adaptorsequenzen (F-AD, R-AD) eingeführt (Modifiziert nach Roche). b Nach Emulsions-PCR und Pyrosequenzierung wurden die Klonsequenzen mithilfe der AVA-Software der Firma Roche analysiert. Die Datenanalyse zeigte im Pyrogramm und in der „Read“-Auswertung die L858R-Punktmutation im Exon 21 des EGFR

https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1007%2Fs00292-012-1704-7/MediaObjects/292_2012_1704_Fig6_HTML.jpg
Abb. 6

a NGS („next generation sequencing“)-Mutationsanalyse von NSCLC („non-small cell lung cancer“, Beispiel 1). NSCLC-relevante Genloci wurden von DNA-makrodisseziierter NSCLC im Einzelansatz amplifiziert. Die Amplikons wurden mit Adaptern ligiert und anschließend auf der Ion-Torrent-Plattform sequenziert. Die Datenanalyse durch den „Integrative Genome Viewer“ zeigt eine Basenaustausch-Mutation (c35G > A) am Kodon 12 des KRAS-Gens, die zum Aminosäureaustausch G12D und zur konstitutiven Aktivierung des KRAS-Gens führt. b Multiplex-NGS-Mutationsanalyse von NSCLC (Beispiel 2) Jeweils 10 ng DNA-makrodisseziierter NSCLC wurden in einer Multiplex-PCR für eine Vielzahl von tumorrelevanten Genen („lung cancer panel“) amplifiziert, mit Adaptern ligiert, anschließend auf der MiSeq-Plattform sequenziert und mit der SeqNext Software (JSI Medical Systems, GER) ausgewertet. Die Datenanalyse zeigt eine Deletion im Exon 19 (E19 p.E746_A750del) des EGFR („epidermal growth factor receptor“)-Gens an

Fazit für die Praxis

  • Für die molekularpathologische Diagnostik der Lungenkarzinome mit immer weitreichenderen molekulargenetischen Anforderungen bieten sich die neuen Sequenzierformen als zeit-, kosten-, und materialsparende Angehensweise an.

  • Die Möglichkeit der Parallelisierung erlaubt eine Vielfalt an genetischen, tumor- und therapierelevanten Loci bei mehreren Patienten gleichzeitig zu untersuchen.

  • Durch das Prinzip, die DNA-Moleküle zu vereinzeln und anschließend jeweils ausgehend von einem Molekül einen Klon herzustellen, der dann sequenziert wird, kann der Anteil und die Komposition der detektierten Varianten in einer DNA-Population angegeben und erheblich sensitiver detektiert werden.

Interessenkonflikt

Die korrespondierende Autorin weist auf folgende Beziehungen hin: Studien zur EGFR-Analyse beim nichtkleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) von Margarete Odenthal und Reinhard Büttner wurden von der Firma Roche unterstützt. Margarete Odenthal und Reinhard Büttner erhielten ebenfalls Reisemittel von der Firma Roche, Novartis, AstraZeneca, Merck-Serono, Lilly-Pharma, Böhringer Ingelheim für den Besuch internationaler Konferenzen (European Congress of Pathology, ECP; Congress of the United States and Canadian Academy of Pathology, USCAP) zur Berichterstattung über ausgewählte Konferenzbeiträge. Claudia Vollbrecht, Katharina König und Lukas Heukamp geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Supplementary material

292_2012_1704_MO1_ESM.pdf (1.5 mb)
Tabelle 1: Tumor- und therapierelevante genetische Veränderungen im Lungenkarzinom (PDF 1,6MB)

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