, Volume 4, Issue 1, pp 260-268

Staining of intracellular granules in fresh epiphyseal cartilage by cationic dyes

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Abstract

Hand-cut sections of fresh epiphyseal cartilage from young rats were stained at pH 4.5 in 0.01% solutions of various cationic dyes of the thiazine, oxazine, azine, triphenylmethane, acridine, and phthallocyanin classes. The intracellular β-and γ-metachromatic granules, previously demonstrated in fresh tissues with toluidine blue, were also demonstrated well with azure A, methylene blue, and brilliant cresyl blue. The granules were also demonstrated, but not as well, by thionin, neutral red, safranin O, toluylene blue, and acridine orange. Under the conditions of staining, the reserve zone matrix and the lower hypertrophic (calcifying) zone matrix stained, whereas the proliferative and upper hypertrophic zone matrix did not stain.

Gallocyanin, crystal violet, basic fuchsin, azocarmine B, gallamine blue, and alcian blue either did not stain, or gave a different pattern of staining from that described above.

It is suggested that the pK and molecular weight of the dyes are important, but not necessarily the only factors in determining the staining of the granules. The results indicate that there is a change in the metachromatic material (presumably proteinpolysaccharide) in both the matrix and cells of epiphyseal cartilage, which appears to be related to calcification.

Résumé

Des coupes de cartilage épiphysaire frais de jeunes rats, effectuées à la main, sont colorées à pH=4,5 dans des solutions à 0,01% de divers colorants cationiques, appartenant aux groupes de la thiazine, oxazine, azine, triphénylméthane, acridine, et phthallocyanine. Les granules intracellulaires métachromatiques, mises en évidence antérieurement par le bleu de toluidine, sont également identifiées à l'aide de l'azur A, le bleu de méthylène et le bleu de crésyl. Les granules se colorent moins bien à la thionine, le rouge neutre, la safranine O, le bleu de toluylène et l'acridine orange. Dans les conditions utilisées, la matrice de la zone de réserve et la matrice de la zone hypertrophique inférieure (en voie de calcification) se colorent, alors que les matrices des zones prolifératives et hypertrophiques supérieures ne prennent pas les colorants.

La gallocyanine, le violet cristal, la fuchsine basique, l'azocarmin B, le bleu de gallamine et la bleu alcian ne se colorent pas ou donnent des réactions colorées différentes de celles décrites ci-dessus.

Il semble que le pK et le poids moléculaire des colorants jouent un rôle important, mais ils ne paraissent pas être les seuls facteurs intervenant dans la coloration des granules. Un changement, lié à la calcification, semble intervenir au niveau du matériel métachromatique (probablement des polysaccharides protéiques), aussi bien dans la matrice que les cellules cartilagineuses épiphysaires.

Zusammenfassung

Handpräparierte Schnitte von frischem Epiphysenknorpel junger Ratten wurden bei einem pH von 4,5 in 0,01% igen Lösungen verschiedener kationischer Farbstoffe folgender Klassen gefärbt: Thiazin, Oxazin, Azin, Triphenylmethan, Acridin und Phthalocyanin. Die intracellulären β-und γ-metachromatischen Granula, erstmals mit Toluidinblau im frischen Gewebe nachgewiesen, konnten auch gut mit Azur A, Methylenblau und Brillantkresylblau dargestellt werden. Die Granula konnten ebenfalls, aber weniger gut, mit Thionin, Neutralrot, Safranin D, Toluylenblau und Acridinorange gefärbt werden. Unter diesen Färbungsbedingungen werden die inaktive Matrixzone und die untere hypertrophische (verkalkende) Matrixzone angefärbt, während die proliferative und die obere hypertrophische Matrixzone sich nicht färben.

Gallocyanin, Kristallviolett, basisches Fuchsin, Azokarmin B, Gallaminblau und Alzianblau färbten entweder gar nicht, oder gaben ein anderes als das obenbeschriebene Färbemuster. Es wird vorgeschlagen, daß das pK und das Molekulargewicht der Farbstoffe wichtig aber nicht unbedingt die einzigen Faktoren sind, die die Färbung der Granula bestimmen.

Die Resultate zeigen, daß eine Veränderung im metachromatischen Material (vermutlich Proteinpolysaccharide) vorliegt, und zwar sowohl in der Matrix als in den Zellen des Epiphysenknorpels; diese Veränderung scheint im Zusammenhang mit der Verkalkung zu stehen.

Supported in part by grant AM 05922 from the National Institute of Arthritis and Metabolic Diseases, Contract AT (30–1) 2960 from the U.S. Atomic Energy Commission, and a grant for general research support given by the USPHS to State University of New York, Downstate Medical Center.