Qualitätssicherung in der diagnostischen In-situ-Hybridisierung – Erfahrungen der QuIP

Zusammenfassung

Die „Qualitätssicherung-Initiative Pathologie“ (QuIP) bietet den Pathologen die Möglichkeit, die methodischen Abläufe der immunhistologischen und molekularen Diagnostik ergebnisorientiert überprüfen und zertifizieren zu lassen. Für die In-situ-Hybridisierungs- (ISH-)Diagnostik wurden 2019 5 Ringversuche angeboten, 2 wiederkehrende (HER2-ISH-Magenkarzinome und HER2-ISH-Mammakarzinome) sowie 3 prototypische (ROS1-NSCLC, ALK1-NSCLC, NTRK). Dabei richten sich die angebotenen RV nach der Entwicklung in der Diagnostik und der Bedeutung der therapeutischen Relevanz, die mit den abzufragenden Molekülen und der damit einhergehenden Methoden verbunden ist. Die Ergebnisse der RV zeigten 2019 eine Sensitivität von mindestens 94,4 % und eine Spezifität von mindestens 96,6 % sowie einer Erfolgsquote von 85–99 %. Dies spricht für einen hohen Qualitätsstandard der RV und der teilnehmenden Institute

Abstract

The Quality Assurance Initiative Pathology (QuIP) gives pathologists the opportunity to check the methodological processes of immunohistological and molecular diagnostics in a result-oriented manner and obtain a certificate reflecting the quality. For in situ hybridization (ISH), 5 round robin tests were organized in 2019, two recurrent (HER2-ISH gastric carcinomas and HER2-ISH breast carcinomas) and three prototypical (ROS1-NSCLC, ALK1-NSCLC, NTRK). The different round robin tests, which were provided by QuIP, are based on the development in diagnostics and the importance of the therapeutic relevance of the molecules which are tested. The results of the round robin tests in 2019 showed a sensitivity of at least 94.4%, a specificity of at least 96.6%, and a success rate of 85–99%. This reflected the high standard of quality of the round robin test and the participating institutes.

Die „Qualitätssicherung-Initiative Pathologie“ (kurz genannt QuIP) besteht seit 2004 und ist seit Anfang 2016 eine GmbH. Es ist ein gemeinsames Unternehmen der Deutschen Gesellschaft für Pathologie (DGP) und des Bundesverbandes Deutscher Pathologen (BDP). Ziel der QuIP ist es, den Pathologen in Deutschland und dem deutschsprachigen Ausland die Möglichkeit zu bieten, die methodischen Abläufe der immunhistologischen und molekularen Diagnostik ergebnisorientiert überprüfen und zertifizieren zu lassen. Dabei sind die Ringversuche methodenoffen und zumeist entitätenbezogen. Organisation und Durchführung eines Ringversuchs sind von verschiedenen Faktoren abhängig. Dazu gehören insbesondere der Bedarf seitens der Pathologen, der über die Community u. a. durch Umfragen ermittelt wird, sowie dessen Bedeutung für die klinisch-therapeutische Anwendung.

Die für die molekularen Ringversuche der QuIP verwendeten Fälle werden vorab von 1–3 Lead-Instituten zusammengestellt und ggf. bereits untereinander gegengetestet, d. h. die Institute analysieren die zugesendeten Fälle und tauschen ihre Ergebnisse aus. Im Anschluss daran werden geeignete Fälle identifiziert und von den Panelinstituten (zumeist 2–5) erneut gegengetestet. In den jeweiligen Ringversuch werden nur die Fälle eingeschlossen, die von allen vorab testenden Instituten einheitlich interpretiert worden sind. Zudem werden sie definierten Zwischenkontrollen unterzogen. Anhand dieser Vortestungen werden sog. Sollwerte für den Ringversuch erstellt, die dann als Grundlage für die Ergebnisermittlung der Teilnehmer dienen. Pro RV wird nicht mehr als ein Grenzfall gewählt.

Alle Ergebnisse, die davon abweichen, werden als falsch eingestuft. Diese im Ringversuch divergent bewerteten Fälle werden in der Regel von dem Lead-Panelinstitut auf mögliche Materialmängel untersucht. Bei der Nachbegutachtung ist es z. T. in Abhängigkeit von der Methode (z. B. FISH) aufgrund des Zerfalls des Hybridisierungsprodukts schwierig, definitive Aussagen über die Ursache (falsche Hybridisierungstechnik, Interpretationsprobleme) zu treffen.

Insbesondere bei prototypischen Ringversuchen, die einen ersten Überblick über die Versorgungslandschaft verschiedener Methoden verschaffen, ist es von Bedeutung, die Sensitivität und Spezifität der jeweiligen Methoden zu berechnen. Dabei wird bei der Sensitivität der Quotient aus den positiven Einzelergebnissen (Sollwerte) und der Gesamtanzahl der reellen positiven Ergebnisse (Angaben der Teilnehmer) berechnet. Die Sensitivität gibt somit an, inwieweit die jeweilige Methode positive Ergebnisse detektieren kann. Die Spezifität wird als Quotient aus den negativen Einzelergebnissen (Sollwerte) und der Gesamtanzahl der reellen negativen Ergebnisse (Angaben der Teilnehmer) berechnet. Die Spezifität kann somit darüber Auskunft geben, inwiefern eine Methode richtig negative Ergebnisse erzielt.

Im Jahr 2019 wurden von der QuIP 18 immunhistologische und 20 molekulare Ringversuche angeboten, wovon fünf Ringversuche mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) als Methode durchgeführt wurden:

• HER2-Mammakarzinome,

• HER2-Magenkarzinome,

• ROS1-NSCLC,

• ALK1-NSCLC,

• NTRK (entitätsübergreifend).

Die HER2-Ringversuche gehören zu den wiederkehrenden Ringversuchen, die einmal jährlich angeboten werden. Bei den übrigen drei handelt es sich um sog. prototypische Ringversuche, die aufgrund ihrer speziellen Ausrichtung bisher entweder einmalig oder maximal 2‑mal (ALK-Lungenkarzinome) durchgeführt wurden.

HER2-Magenkarzinome

Das HER2 wurde als ein prädiktiver Biomarker bei Magenkarzinomen identifiziert. Der Erfolg der Therapie mit einem monoklonalen HER2-Antikörper ist abhängig von der Expression des HER2-Proteins bzw. bei einer Amplifikation des HER2-Gens von der Höhe des HER2-Expressionslevels [1]. Aus diesem Grund führt die QuIP seit mehreren Jahren den Ringversuch HER‑2-Magen durch, an dem die Institute entweder mit Immunhistologie oder In-situ-Hybridisierung teilnehmen können. Die Zahl der Teilnehmer beim HER2-ISH-Magen-Ringversuch ist über die Jahre 2016 bis 2019 mit 50 bis 64 deutlich niedriger (Tab. 1 und 2) als bei dem Ringversuch HER2-ISH-Mammakarzinom.

Tab. 1 Teilnehmerzahl und Erfolgsquote des HER2-Ringversuchs Magenkarzinome

Tab. 2 Teilnehmerzahl und Erfolgsquote des HER2-Ringversuches Mammakarzinome

Der Ringversuch gilt für den einzelnen Teilnehmer als bestanden, wenn 90 % der untersuchten Fälle richtig (anhand der Sollwerte) bewertet wurden. Der Ringversuch HER2-Magenkarzinome kann über die Jahre als erfolgreich angesehen werden, auch wenn 2018 die Erfolgsquote im Vergleich zu den übrigen Jahren mit 84 % geringer war (Tab. 1). Von den 58 Instituten, die am Ringversuch HER2-Magen 2018 teilnahmen, beantworteten 57 die Fragen zu den Methoden. Sechs der Institute, die an dem HER2-Magen-Ringversuch ohne Erfolg teilnahmen, verwendeten die CISH als Untersuchungsmethode und 2 Institute die SISH (Abb. 1). Drei der Institute ohne erfolgreiche Teilnahme führten die Untersuchungen mit dem Kit von Zytovision, drei mit dem Kit von Zytomed und zwei mit dem Kit von Ventana durch (Abb. 2). Der Review dieser Fälle zeigte bei allen Teilnehmern falsch-negative Ergebnisse. Bei dem aktuellen Ringversuch von 2019 nahmen 48 Institute mit und 2 ohne Erfolg teil. Beide Institute ohne erfolgreiche Teilnahme verwendeten als Untersuchungsmethode die CISH (Abb. 3) und das Detektionssystem der Firma Zytovision (Abb. 4). Die sich aus dem Ringversuch abgeleitete Sensitivität für die ISH liegt bei 97,3 % und die Spezifität bei 96,6 %. Die Ergebnisse legen nahe, dass die FISH-Methode gegenüber der CISH-Untersuchung weniger fehleranfällig erscheint.

Abb. 1

Verwendete Methoden beim HER2-ISH-Ringversuch Magenkarzinome 2018 (CISH chromogene In-situ-Hybridisierung; FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; SISH Silber-in-situ-Hybridisierung; BDISH Brightfield-Double-in-situ-Hybridisierung)

Abb. 2

Verwendete Kits (nach Hersteller) beim HER2-ISH-Ringversuch Magenkarzinome 2018: Abbott Vysis FISH PathVysion HER2-DNA-Sonden-Kit II, Dako Agilent FISH HER2 IQFISH pharmDx, Ventana CISH INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay, Ventana SISH VENTANA HER2 Dual ISH Assays, Ventana BDISH VENTANA HER2 Dual ISH Assays, ZytoVision CISH ZytoDot® 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe, ZytoVision FISH ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe

Abb. 3

Verwendete Methoden beim HER2-ISH-Ringversuch Magenkarzinome 2019 (CISH chromogene In-situ-Hybridisierung; FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; SISH Silber-in-situ-Hybridisierung; BDISH Brightfield-Double-in-situ-Hybridisierung)

Abb. 4

Verwendete Kits (nach Hersteller) beim HER2-ISH-Ringversuch Magenkarzinome 2019: Abbott Vysis FISH 1 PathVysion HER2-DNA-Sonden-Kit II, Abbott Vysis FISH 2 PathVysion®* LSI® HER2/CEP17® FISH probes, Dako Agilent FISH HER2 IQFISH pharmDx, Ventana CISH INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay, Ventana FISH INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay, Ventana SISH VENTANA HER2 Dual ISH Assays, Ventana BDISH VENTANA HER2 Dual ISH Assays, ZytoVision CISH ZytoDot® 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe, ZytoVision FISH 1 ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe, ZytoVision FISH 2 ZytoMation® ERBB2/CEN 17 Dual Color FISH Probe

HER2-Mammakarzinome

Der Ringversuch HER2-Mammakarzinome wird in Kooperation mit der Firma multiblock GmbH organisiert, durchgeführt, ausgewertet und seit Jahren als wiederkehrender RV angeboten. Die primäre Initiierung beruhte auf der Tatsache, dass vor der Gabe des therapeutischen monoklonalen Antikörpers Herceptin® der HER2-Status gefordert wird. Die Bestimmung erfolgt mittels Immunhistologie und ISH [2]. Der Ringversuch HER2-ISH-Mamma verzeichnet von allen ISH-Ringversuchen die höchste Teilnehmerquote. Die Fallauswahl für die Ringversuche und der Review erfolgte analog wie für die immunhistochemischen Ringversuche ausführlich beschrieben [3]. Für jeden gültigen Testfall konnten maximal 3 Punkte erzielt werden (d. h. voll Übereinstimmung mit dem vorab festgelegten Erwartungswert). Lagen Abweichungen vom Erwartungswert vor, wurden entsprechend weniger oder gar keine Punkte vergeben. Am Ende wurde die erreichte mit der maximal erreichbaren Punktzahl aller Testfälle prozentual umgerechnet (z. B. abgeschwommene Stanzen wurden so nicht gewertet), die Bestehensgrenze lag bei 90 %. Über die Jahre von 2016 bis 2019 rangieren die Teilnehmerzahlen gleichbleibend zwischen 103–131 Teilnehmern (Tab. 2). Der RV gilt als bestanden, wenn 90 % der untersuchten Fälle Übereinstimmungen mit den entsprechenden Sollwerten zeigten.

Aus der Tab. 2 ist zudem ersichtlich, dass die Erfolgsquoten 2016, 2018 und 2019 mit 98,5–100 % sehr hoch waren und in diesen Jahren keine Qualitätsmängel seitens der Teilnehmer vorlagen. Das Jahr 2017 stellte mit einer Erfolgsquote von nur 61 % eine Ausnahme dar. Die Auswertung der in diesem Ringversuch verwendeten Kits zeigte, dass herstellerübergreifend die Quote der Teilnehmer, die nicht bestanden hatten hoch war. Anhand der verwendeten Sonden, herstellerbezogen, konnte also kein Zusammenhang zwischen dem erfolgreichen Bestehen oder einer Teilnahme ohne Erfolg gesehen werden (Abb. 5).

Abb. 5

Verwendete Kits (nach Hersteller) beim HER2-ISH-Ringversuch Mammakarzinome 2017: Abbott Vysis 1 PathVysion HER2-DNA-Sonden-Kit II (FISH), Abbott Vysis 2 PathVysion®* LSI® HER2/CEP17® FISH probes (FISH), Dako Agilent 1 HER2 CISH pharmDx Kit (CISH), Dako Agilent 2 HER2 IQFISH pharmDx (FISH), Ventana 1 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay (CISH + FISH), Ventana 2 VENTANA HER2 Dual ISH Assays (BDISH + SISH), Ventana 3 ultraView Red ISH DIG Detection Kit, ZytoVision 1 ZytoDot® 2C SPEC ERBB2/CEN 17 Probe (CISH), ZytoVision 2 ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe (FISH)

Trotz intensiver Analyse konnte insgesamt nicht geklärt werden, was die Ursache für dieses vergleichsweise schlechte Ergebnis war. Mit Wahrscheinlichkeit wird abschließend die Fixierungsqualität mehrerer Stanzen für diesen Effekt verantwortlich gemacht, ohne dass bei den Vortestungen hier Hinweise bzw. Probleme aufgefallen waren. Die beiden darauf folgenden Jahre zeigten erfolgreiche Ringversuche mit hohen Teilnehmerzahlen und Bestehensquoten. Im HER2-ISH-Mammaringversuch von 2019 machten 80 Teilnehmer eine Angabe zum verwendeten Kit (Abb. 6). Hierbei zeigte sich, dass prinzipiell alle Methoden und Kits der verschiedenen Hersteller für die Diagnostik geeignet sind.

Abb. 6

Verwendete Kits (nach Hersteller) beim HER2-ISH-Ringversuch Mammakarzinome 2019: ZytoVision ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe (FISH), Ventana 1 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Assay (FISH + CISH), Ventana 2 VENTANA HER2 Dual ISH Assays (SISH + BDISH), Abbott Vysis PathVysion HER2-DNA-Sonden-Kit II (FISH)

ROS1-NSCLC

Chromosomale Rearrangements haben 1–2 % der nicht kleinzelligen Lungenkarzinome (NSCLC), bei denen das ROS1-Gen (c-ros oncogene 1) involviert ist. Die daraus resultierende Fusion führt zu einer onkogenen Transformation und konstitutiven Kinaseaktivierung [4]. Da Patienten mit einer ROS1-Fusion von einer zielgerichteten Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren profitieren, wurde 2019 erstmals ein Ringversuch zum molekularpathologischen Nachweis von ROS1 mittels der In-situ-Hybridisierung im Rahmen eines prototypischen Ringversuchs initiiert. Der ROS1-Ringversuch konnte neben der ISH mit den Methoden Immunhistologie und NGS bestritten werden. Die drei Methodenteile konnten einzeln oder in Kombination angefordert werden. Insgesamt wurden pro Methodenteil 10 Fälle als Ganzschnitte für die Untersuchung zur Verfügung gestellt. Die Bestehensgrenze für den ISH-Ringversuch lag bei 90 %, somit durfte ein Fall abweichend eingeordnet werden. Von den 20 teilnehmenden Instituten bestanden 17 mit Erfolg, was einer Erfolgsquote von 85 % entspricht. Die Erfolgsquote bei dem NGS-Teil lag bei 76 % und für den IHC-Teil bei 90 %. Von den drei Instituten ohne erfolgreiche Teilnahme verwendeten 2 die FISH- und eine die CISH-Methode (Abb. 7). Abb. 8 zeigt die verwendeten Sonden bezogen auf die Herstellerfirmen sortiert nach erfolgreicher und nicht erfolgreicher Teilnahme. 17 Teilnehmer werteten die Fälle manuell aus, 3 Teilnehmer wählten eine computerbasierte Auswertungsunterstützung. Die 3 Teilnehmer, die den Ringversuch nicht bestanden, hatten die Fälle manuell ausgewertet. Im Detail beurteilte ein Institut ohne erfolgreiche Teilnahme einen Fall als falsch-positiv und einen als nicht auswertbar. Ein weiteres Institut bewertete 2 Fälle als falsch-negativ. Das dritte ohne Erfolg teilnehmende Institut, beurteilte jeweils einen Fall als falsch-positiv und einen Fall als falsch-negativ.

Abb. 7

Verwendete Methoden beim ROS1-NSCLC-Ringversuch 2019: FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; CISH chromogene In-situ-Hybridisierung

Abb. 8

Verwendete Kits (nach Hersteller) beim ROS1-NSCLC Ringversuch 2019: Abbott Vysis FISH Vysis ROS1 Break Apart FISH Probe Kit, ZytoVision FISH 1 ZytoLight® SPEC ROS1 Dual Color Break Apart Probe, ZytoVision FISH 2 FlexISH® ALK/ROS1 DistinguISH™ Probe, ZytoVision CISH ZytoDot® 2C SPEC ROS1 Break Apart Probe

ALK-NSCLC

In der Regel treten ALK-Genfusionen bei Patienten mit Adenokarzinomen der Lunge auf, die nie geraucht haben. Die Inzidenz von ALK-Fusionen beim NSCLC liegt bei 3–5 % [5]. Da diese Patienten einen Nutzen aus der Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren ziehen, wurde ein ALK-NSCLC-Ringversuch konzipiert. Er setzte sich, ähnlich wie der ROS1-NSCLC-Ringversuch, aus drei Methodenteilen (IHC, ISH, NGS) zusammen. Bei dem ALK-ISH-Ringversuch wurden den Teilnehmern 10 Fälle auf TMA zur Verfügung gestellt. Die Bestehensgrenze lag bei 90 %. Der ALK-Ringversuch wurde erstmals 2014 durchgeführt und im Jahr 2019 wiederholt. Während 2014 3 Teilnehmer den Ringversuch nicht bestanden, war es im Ringversuch 2019 nur ein Teilnehmer (Tab. 3). Das Institut ohne erfolgreiche Teilnahme verwendete die CISH-Methode (Abb. 9). Der Teilnehmer ohne erfolgreiche Teilnahme verwendete die ZytoLight® SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe von der Firma ZytoVision (Abb. 10). Mit einer Erfolgsquote von 97 % ist der Ringversuch als erfolgreich zu werten und es sind keine grundsätzlichen Qualitätsmängel zu erkennen. Die Erfolgsquote für den IHC-Teil lag bei 87 % und die für den NGS-Teil bei 95 %, dies deutete daraufhin, dass die ISH eine gut etablierte Methode für die Diagnostik der ALK-Translokationen ist.

Tab. 3 Teilnehmerzahl und Erfolgsquote des ALK1-Ringversuchs NSCLC

Abb. 9

Verwendete Methoden beim ALK-NSCLC-Ringversuch 2019: FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; CISH chromogene In-situ-Hybridisierung

Abb. 10

Verwendete Kits (nach Hersteller) beim ALK-NSCLC-Ringversuch 2019: Abbott Vysis FISH Vysis ALK Break Apart FISH-Sonden-Kit, Cytocell FISH ALK Breakapart Probe IFU, ZytoVision CISH ZytoLight® SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe, ZytoVision FISH 1 ZytoLight® SPEC ALK Dual Color Break Apart Probe, ZytoVision FISH 2 ZytoLight® SPEC ALK/EML4 TriCheck™ Probe, ZytoVision FISH 3 FlexISH ® ALK/ROS1 DistinguISH™ Probe

NTRK

Fusionen der drei NTRK-Gene, die für die neurotrophen Tyrosinrezeptorkinasen NTRK1, NTRK2 und NTRK3 kodieren, wurden als onkogene Treiber für viele Krebsarten identifiziert [6]. Um hier eine zielgerichtete Therapie anwenden zu können, ist der Nachweis der zugrunde liegenden Fusion erforderlich. Daher wurde 2019 der NTRK-Ringversuch als prototypischer Ringversuch konzipiert. Hier bestand die Möglichkeit den Ringversuch entweder mit der ISH oder dem NGS zu bestreiten. Insgesamt 9 Teilnehmer meldeten sich für den NTRK-ISH-Ringversuch an. Den Teilnehmern wurden 10 Fälle als Vollschnitte zur Verfügung gestellt. Die Erfolgsquote lag bei 89 %, d. h. 8 Institute nahmen erfolgreich an diesem Ringversuch teil. Insgesamt 7 Teilnehmer gaben die genauen Namen der verwendeten Sonden für die drei NTRK-Gene an. Alle Teilnehmer verwendeten für die Detektion der NTRK1‑3-Fusionen die Sonden der Firma ZytoVision (ZytoLight® SPEC NTRK1/2/3 Dual Color Break Apart Probe), von denen ein Teilnehmer nicht die zu erwartenden Ergebnisse erzielte. Die Erfolgsquote des NGS-Teils betrug 83,3 %, daraus lässt sich schlussfolgern, dass die ISH eine gut etablierte Methode ist um NTRK-Fusionen zu detektieren.

Fazit

Ringversuchsübergreifend scheint die CISH-Methode im Vergleich zu der FISH-Untersuchung fehleranfälliger zu sein, da sowohl bei dem RV HER2-Mamma, als auch bei HER2-Magen und ROS1 die Institute ohne erfolgreiche Teilnahme eher die CISH-Methode etabliert hatten.

Die von der QuIP angebotenen Ringversuche richten sich entsprechend der Entwicklung in der Diagnostik nach der Bedeutung der therapeutischen Relevanz, die mit den abzufragenden Molekülen und der damit einhergehenden Methoden verbunden ist. Da insbesondere die Fusionen von ROS1, ALK und NTRK selten sind, ist sowohl der Nachweis dieser genetischen Alteration nicht in allen Instituten etabliert als auch die Verfügbarkeit von Material, dass für den Ringversuch geeignet ist sehr limitiert. Die hohen Erfolgsquoten der ISH-Ringversuche zeigen, dass sowohl die Qualität der Ringversuche als auch die qualitative Arbeit der teilnehmenden Institute entsprechend hoch ist.